超氧化物歧化酶SOD活性检测全指南：原理方法、实验步骤、试剂盒选型

一、为什么几乎所有氧化应激课题都要测 SOD 活性？

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，EC1.15.1.1）是机体清除超氧阴离子自由基（O₂⁻）的第一道防线，催化 2 分子 O₂⁻ 歧化为 H₂O₂ 和 O₂，是细胞中抵抗活性氧（ROS）损伤的重要抗氧化酶系之一。

在现代研究中，SOD 活性的异常，与多种疾病和模型密切相关，例如：

• 肌萎缩侧索硬化等神经退行性疾病
• 糖尿病、动脉粥样硬化等代谢性与心血管疾病
• 各类急、慢性炎症与缺血再灌注损伤模型
• 多种肿瘤发生发展过程中的氧化应激失衡

因此，在“氧化应激”“抗氧化”“自由基损伤”等相关课题里，SOD 活性检测几乎是标配指标。一般用来反映系统整体的抗氧化防御能力，常与 MDA、CAT、POD、H₂O₂ 等指标联用：

• SOD 活性偏低：提示抗氧化防御受损，更易发生氧化损伤；
• SOD 活性偏高：可能提示机体处于应激状态，正在调动抗氧化防御。

延伸阅读：
《做氧化应激课题，SOD 指标到底怎么选试剂盒？附 SOD+MDA 经典组合方案》

二、SOD 活性检测的常见方法概览

目前实验室常见的 SOD 活性检测方法大致包括：

1. NBT 法
• 以 NBT 还原生成蓝色甲臜为读数终点；
• 方法经典，但部分条件下易受干扰，操作步骤相对较多。
2. 细胞色素 c 法
• 通过监测细胞色素 c 的还原程度推算 O₂⁻ 水平；
• 对仪器条件、操作规范要求较高，适合设备条件较好的实验室。
3. WST-8 微量法
• 利用水溶性四唑盐 WST-8 与 O₂⁻ 反应生成黄色甲臜，在 450 nm 处有特征吸光度；
• 体系水溶性好、信号稳定，特别适合 96 孔板高通量检测。

综合来看，如果你的实验室以 96 孔板和酶标仪为主，样本类型多、通量需求大，WST-8 微量法的 SOD 试剂盒往往是更稳妥的选择。

延伸阅读：
《SOD 活性测定原理详解：从超氧阴离子到 WST-8 450 nm 吸光度》
《NBT 法、细胞色素 c 法还是 WST-8 微量法？SOD 活性检测方法优缺点一文看懂》

三、WST-8 微量法检测原理（以 CheKine™ SOD 试剂盒为例）

CheKine™ 超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（微量法）采用经典的黄嘌呤 / 黄嘌呤氧化酶（XO）–WST-8 体系：

1. 黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤生成超氧阴离子（O₂⁻）；
2. O₂⁻ 与 WST-8 反应生成黄色水溶性甲臜，在 450 nm 处产生吸光度信号；
3. 样本中的 SOD 可以清除 O₂⁻，从而抑制甲臜生成；
4. 显色越浅，说明 O₂⁻ 越少，SOD 活性越高；显色越深，则说明 SOD 活性较低。

在这一体系中，通常约定：当抑制率为 50% 时，反应体系中的 SOD 活力定义为 1 U。实际检测中，先算出抑制百分率，再换算为 U/g、U/mL、U/mgprot 等不同单位的 SOD 活性。

以 CheKine™ SOD 试剂盒为例，关键组分包括：

• Assay Buffer
• Sample Diluent
• 5× Lysis Buffer
• WST-8
• Enhancer
• Xanthine Oxidase
• Xanthine

产品特点中强调：

• 可测定血清、血浆、动植物组织、细胞裂解物及其他生物体液中的 SOD 活性；
• 采用 WST-8 微量法，最大抑制率可接近 100%，对一些常见干扰因素不敏感。

这类设计，让它兼顾多样本适用 + 操作相对简单 + 高通量友好的特点。

四、如何选择合适的 SOD 活性检测试剂盒？—— 8 个关键点

对于真正要“买 kit 做实验”的课题组，与其只看品牌名，不如先按下面 8 个维度筛一遍，再看谁更匹配你的需求。

1. 适用样本类型

优先选择能覆盖多种样本类型的试剂盒，例如：

• 血清 / 血浆
• 动物组织（肝、心、肾、脑等）
• 植物组织
• 细胞、细菌或其他生物体液

CheKine™ SOD 试剂盒在说明书中明确支持上述多类型样本，对“同一个课题要同时跑多种样本”的情况非常友好。

2. 检测方法与抗干扰能力

查看说明书里的几个关键点：

• 是否采用 WST-8 微量法；
• 是否强调“抑制率范围大”“不易受常见干扰因素影响”；
• 是否为复杂样本设计了样本对照孔和空白对照孔，用于扣除本底。

CheKine™ 使用 XO–WST-8 体系，并设计了空白、空白对照、样本、样本对照等孔型，方便你在复杂体系中控制干扰。

3. 灵敏度与线性范围

不是“越灵敏越好”，而是要看线性范围是否够宽、抑制率是否容易落在合理区间。

通常建议将抑制率控制在 10%–90% 之间：

• 抑制率接近 0%：可能说明样本过稀或酶已部分失活；
• 抑制率接近 100%：可能说明样本过浓，需要稀释。

好的试剂盒会在说明书中明确给出抑制率范围和稀释建议，减少你自己摸索的时间。

4. 操作复杂度与通量

重点看：

• 是否适配 96 孔板、酶标仪（450 nm）；
• 工作液是否能一次性配好、统一加样；
• 步骤是否适合多通道移液器操作。

通俗讲，就是：一板样本能不能在合理时间内做完，还不容易出错。CheKine™ 的操作流程相对标准化，适合高通量实验室整板跑样。

5. 试剂稳定性与保存条件

• 整盒产品建议在什么温度保存？
• 关键液体是否要避光？
• 收到货后有效期多长？

CheKine™ SOD 试剂盒建议避光保存于 −20℃，自发货之日起在推荐条件下有效期 6 个月，并在说明书中对各组分的保存条件做了区分说明。

6. 是否考虑预实验冗余与工具支持

合理的试剂盒会：

• 在标称测试次数基础上预留部分冗余，方便你做预实验；
• 提供在线计算器或 Excel 模板，减少手算出错。

CheKine™ 系列普遍会多配约 10% 试剂量，并配套在线计算器和 Excel 模板，适合需要频繁做 t 检验、绘图的用户。

7. 品牌技术支持与配套产品3

如果你要构建完整的氧化应激 panel，优先选择有配套 MDA、CAT、POD、H₂O₂ 等试剂盒的品牌，便于一站式采购，也方便技术沟通。

CheKine™ 在同一平台下提供 SOD、MDA、CAT、POD、H₂O₂ 等多款微量法试剂盒，有利于数据风格统一、结果对比一致。

8. 合规声明与安全提示

正规的科研试剂盒会在说明书和外包装上清晰标注：

• 仅供科研使用，不应用于人体或临床诊断；
• 注意操作防护、避免试剂误触和吸入。

这些内容看似“官方”，但也是规范实验室管理的重要一环。

延伸阅读：
《SOD 活性检测试剂盒怎么选？这 8 个参数没看清，别急着下单》
《第一次买 SOD 试剂盒，一定会问的 10 个问题》

五、实验前准备：样本、仪器与试剂

1. 仪器与耗材

以 CheKine™ SOD 试剂盒为例，一般需要：

• 可在 450 nm 处读板的酶标仪；
• 96 孔透明酶标板；
• 匀浆器或研磨器、冰浴超声仪（视样本类型而定）；
• 低温离心机、水浴锅或恒温箱；
• 单道 / 多通道移液器及配套枪头；
• 冰盒、离心管、PBS 或其他缓冲液。

2. 试剂处理注意事项

• 所有试剂开盖前先低速离心，使瓶壁挂液回到底部；
• 实验前，将需要在室温下使用的试剂恢复至约 25℃；
• 黄嘌呤类试剂可能轻微混浊，使用前充分涡旋混匀；
• WST-8、酶溶液等关键组分操作全程尽量避光，冰上进行，避免反复冻融；
• 如果未立即检测，样品可置于 −80℃ 短期保存，但不宜多次冻融。

3. 样本制备概览

不同样本类型，常见处理思路可以概括为：

• 动物组织 / 植物组织
• 称取一定质量的组织；
• 加入预冷裂解液匀浆或研磨，必要时冰浴超声；
• 低温高速离心，取上清用于检测。
• 细胞 / 细菌样本
• 计数后收集一定数量细胞或菌体；
• PBS 清洗后弃上清；
• 加入裂解液，冰浴超声破碎；
• 离心，取上清测定。
• 血清 / 血浆
• 按常规方法制备；
• 按说明书推荐比例用 Sample Diluent 稀释后上机测定。

正式实验前，建议用少量样本做预实验，预估合适的稀释倍数和抑制率范围，再铺开做大批量检测。

延伸阅读：
《SOD活性检测步骤实战手记：血清、组织、细胞一篇搞定》

六、操作流程总览：从配液到 450 nm 读板

不同品牌的具体体系体积和比例略有差异，下面以典型 WST-8 微量法体系为例，给出“鸟瞰版”流程（具体数值以说明书为准）：

1. 配制工作液（Working Reagent）
• 按说明书比例，将 Assay Buffer、底物、WST-8、Enhancer 等组分混合；
• 充分混匀后，在指定温度（如 37℃ 或 25℃）预孵育数分钟备用。
2. 配制 Working Xanthine Oxidase（如有要求）
• 用 Sample Diluent 按推荐倍数现配 XO 工作液；
• 操作过程中全程置于冰上，避免酶活性下降。
3. 布板设计

常见孔型包括：

• 空白孔（Blank）：工作液 + XO，无样本；
• 空白对照孔（Blank Control）：仅有工作液，无样本、无 XO；
• 样本孔（Sample）：样本 + 工作液 + XO；
• 样本对照孔（Sample Control）：样本 + 工作液，无 XO。

不同试剂盒对体积搭配略有差异，但总体思路类似：通过成对的对照孔，扣除工作液及样本本底。

1. 加样与孵育

• 按设计向各孔加入相应体积的样本、稀释液、XO 和工作液；
• 加样完成后轻轻拍板或短暂离心，确保液体均匀；
• 放入 37℃ 或 25℃ 孵育一定时间（例如 30 min）。

1. 读数

• 孵育结束后，在 450 nm 处读取各孔吸光度；
• 记录每一类孔的 A 值，用于后续计算。

延伸阅读：
《高通量实验室如何布局 SOD 检测？一板搞定 8 组模型+标准》

七、SOD 活性计算与结果解读

1. ΔA 与抑制率

一般先做背景校正：

• ΔA（样本） = A（样本孔） − A（样本对照孔）
• ΔA（空白） = A（空白孔） − A（空白对照孔）

然后计算抑制率：

抑制率（%） = [ΔA（空白） − ΔA（样本）] ÷ ΔA（空白） × 100

抑制率越高，说明样本中 SOD 活性越强。通常推荐：

• 抑制率控制在 10%–90% 之间；
• 若抑制率接近 0%，考虑减少稀释或增加上样；
• 若抑制率接近 100%，考虑增加稀释倍数。

2. 不同单位下的 SOD 活性

根据样本类型和发表要求不同，常见归一化方式包括：

• U/g：按样本质量归一化，常用于组织样本；
• U/mL：按反应体系体积或原始样本体积归一化，常用于血清、血浆、培养上清等；
• U/10⁴ cells：按细胞数量归一化，适合细胞或细菌实验；
• U/mgprot：按蛋白含量归一化，需要额外做蛋白定量（如 BCA）。

具体公式各品牌略有差异，一般说明书会给出统一的换算公式。以 CheKine™ 为例，你可以：

• 按说明书给出的公式手算；
• 或直接使用配套的在线计算器 / Excel 模板工具，输入原始 A 值和必要参数，即可自动得到结果。

延伸阅读：
《SOD 活性计算公式与单位选择：抑制率、U/g、U/mL、U/mgprot 一篇讲清》

3. 结果解读思路

• 对比对照组：
• 处理组 SOD 活性明显升高，可能提示机体调动抗氧化防御以对抗 ROS 升高；
• 处理组 SOD 活性明显下降，可能提示抗氧化系统被抑制或严重受损。
• 联合其他指标：
• SOD 活性下降 + MDA 显著升高：常见于脂质过氧化损伤明显的情况；
• SOD 联合 CAT、POD、H₂O₂ 等指标，可从多个层面评价氧化应激状态。

八、常见问题与故障排查

1. 抑制率太高，接近 100%

现象： 样本孔显色很浅，ΔA（样本）明显小于 ΔA（空白）。

可能原因：

• 样本中过量 SOD，稀释倍数偏小；
• 上样体积过大。

建议：

• 增大稀释倍数或减少上样体积；
• 设计一组稀释梯度，找到合适的线性区间。

2. 抑制率太低，接近 0%

现象： 样本孔与空白孔显色差不多。

可能原因：

• 样本中 SOD 含量本身较低；
• 样本制备过程中温度控制不佳或反复冻融，酶部分失活。

建议：

• 减小稀释倍数或增加上样量；
• 优化样本制备流程，全程冰上操作，减少常温放置时间。

3. 背景高、本底差异大

现象： 样本对照孔 A 值较高，不同样本之间本底差异明显。

可能原因：

• 样本本身颜色较深；
• 含有还原性物质或其他干扰成分。

建议：

• 必须设置样本对照孔，扣除样本本底；
• 对特别“脏”的样本，适当增加稀释倍数；
• 必要时可在课题设计阶段考虑更适合该样本类型的处理方案。

4. 重复性差

可能原因：

• 工作液未一次性配足，各孔实际浓度不一致；
• 加样顺序混乱，孵育时间不统一；
• 板边效应明显，或操作中出现局部干板等问题。

建议：

• 工作液一次性配足，充分混匀后使用；
• 尽量使用多通道移液器，统一加样节奏；
• 尽可能在同一批次内完成同一组比较的所有样本。

延伸阅读：
《SOD 实验失败怎么办？抑制率过高/过低、背景大 4 大原因与处理建议》
《SOD 实验踩坑记：从用户反馈中总结出的 6 个小贴士》

九、SOD 与 MDA、CAT 等指标的联合应用

在大多数氧化应激相关研究中，单独测 SOD 并不足以完整描述状态，通常会与以下指标组合使用：

• MDA（丙二醛）：脂质过氧化产物，反映膜脂损伤程度；
• CAT（过氧化氢酶）：分解 H₂O₂，参与 H₂O₂ 清除；
• POD（过氧化物酶）及 H₂O₂ 含量：补充过氧化物生成与清除信息；
• 视课题需要，还可加入 GSH/GSSG、GSH-Px 等指标。

典型组合示例：

• SOD + MDA：常用于评价整体氧化应激水平及脂质过氧化程度；
• SOD + CAT + H₂O₂：更关注 H₂O₂ 生成与清除的动态平衡；
• SOD + MDA + POD / GSH-Px：广泛用于肝损伤、肾损伤、心肌缺血再灌注等模型。

如果希望“一套指标跑到底”，可以优先选择同一品牌下的整套试剂盒组合，例如：

• 使用 CheKine™ 超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（微量法）检测 SOD；
• 搭配 CheKine™ MDA 试剂盒、CAT 试剂盒、POD 试剂盒、H₂O₂ 试剂盒等，构建统一的平台方案。

延伸阅读：
《做氧化应激课题，SOD 指标到底怎么选试剂盒？附 SOD+MDA 经典组合方案》

十、总结与行动建议

如果你正在考虑在课题中加入 SOD 活性检测，可以按下面这条逻辑来规划：

1. 先明确课题问题
• 是要验证抗氧化干预效果？
• 还是要证明某模型存在明显氧化应激？
• 或者要构建某疾病模型的完整氧化应激图谱？
2. 选择合适的检测方法和试剂盒
• 对于以 96 孔板 + 酶标仪为主、样本类型复杂的实验室，WST-8 微量法的 SOD 试剂盒是更稳妥的选择；
• 像 CheKine™ 这类支持多样本、微量法、配套工具完善的 kit，可以减少方法切换带来的误差和时间成本。
3. 正式实验前先做小规模预实验
• 用少量样本摸清稀释倍数与抑制率范围，把条件调整到 10%–90% 的线性区间，再开展大批量检测。
4. 结合其他指标构建完整 panel
• 根据课题方向，搭配 MDA、CAT、POD、H₂O₂ 等指标，做成一套“氧化应激指标组合”；
• 统一选用同一品牌、同一检测平台，有利于数据的可比性和文章整体质量。
5. 注意安全与合规
• SOD 活性检测试剂盒仅供科研使用，不应用于临床诊断；
• 实验全程注意个人防护，遵守实验室安全规范。

围绕这条路径，你既能系统掌握 SOD 活性检测的基本原理与操作方法，又能更有针对性地选择并使用像 CheKine™ 超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（微量法）这样的成熟产品，把时间和精力更多地投入到课题本身，而不是反复耗在调条件和踩坑上。