SOD活性测定原理详解：从超氧阴离子到WST-8 450 nm吸光度
很多人在搜 “SOD 活性测定原理 / WST-8 SOD 原理” 时，心里其实只有一个问题：
96 孔板上读出来一个 450 nm 的 A 值，这跟细胞里那堆自由基、SOD 活性到底有什么关系？
这篇就从超氧阴离子（O₂⁻）讲到WST-8 at 450 nm，把 WST-8 微量法的 SOD 活性检测思路完整串起来，并且用一套典型的 WST-8 法 SOD kit（如CheKine™ 超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（微量法））做示意，让“原理 = 你们这款”的印象自然种在用户心里。
一、从超氧阴离子说起：SOD 活性到底在“管什么”？
细胞在呼吸链、各种氧化反应中，会源源不断地产生活性氧（ROS），超氧阴离子 O₂⁻ 是最早出现的一种。如果不及时清除，它会继续转化为更具毒性的 ROS，参与：
- 脂质过氧化 → 细胞膜被打洞，MDA 升高；
- 蛋白氧化 → 酶失活、受体受损；
- DNA 氧化 → 诱发突变、凋亡等。
SOD 的核心功能只有一句话：
把 2 分子 O₂⁻ 变成 H₂O₂ 和 O₂，相当于给细胞的“垃圾焚烧系统”ch减压。
化学式常写成：
2O₂⁻ + 2H⁺ → H₂O₂ + O₂
所以，当我们在实验里测“SOD 活性”时，本质上是想知道：
- 这个样本（组织 / 血清 / 细胞）
- 在单位时间内，到底能消灭多少 O₂⁻？
二、经典思路：不是直接“测 SOD”，而是看它能“抢走多少 O₂⁻”
绝大多数 SOD 活性测定方法（NBT 法、细胞色素 c 法、WST-8 微量法……）背后的逻辑都是同一套：
- 人为制造一个“稳定产生 O₂⁻”的体系
- 比如用黄嘌呤（Xanthine）+ 黄嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase, XO）持续地产生 O₂⁻。
- 往体系里加入一个“对 O₂⁻ 很敏感、会变色”的底物
- 有 O₂⁻ 存在时，底物被还原 / 氧化生成有颜色的产物，在某个波长有明显吸收；
- 没有 O₂⁻ 或 O₂⁻ 被大量清除时，颜色就变浅。
- 把样本丢进去，让样本中的 SOD 来抢 O₂⁻
- SOD 越多，O₂⁻ 越少，底物被转化得越少，颜色就越浅；
- 反过来，SOD 越少，O₂⁻ 越多，颜色越深。
- 用“颜色被压下去的程度”反推 SOD 活性
- 把“没有样本时的显色”当作 100%；
- 看加入样本后，显色被抑制了多少 →抑制率；
- 再根据体系约定，把一定抑制率折算成 SOD 的活性单位 U。
这就是为什么很多说明书都会提到：
“本方法以 SOD 对底物显色反应的抑制率来反映其活性。”
三、WST-8 微量法的核心反应链：XO → O₂⁻ → WST-8 甲臜 → 450 nm
在众多方法中，WST-8 微量法因为适配 96 孔板、信号稳定、灵敏度高，已经成为很多实验室首选。
以 CheKine™ SOD 试剂盒为例，WST-8 法可以拆成三段反应链来理解：
1. 先用 XO 体系“制造”超氧阴离子
- 体系中有：
- 黄嘌呤（Xanthine）
- 黄嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase, XO）
XO 催化黄嘌呤氧化，释放大量 O₂⁻：
Xanthine + O₂ → 尿酸 + O₂⁻
在没有 SOD 的情况下，O₂⁻ 会源源不断产生。
2. 用 WST-8 把 O₂⁻“显色出来”
WST-8 是一种水溶性四唑盐，本身几乎无色：
- 当体系中有 O₂⁻ 时，WST-8 被还原生成黄色水溶性甲臜；
- 这个产物在450 nm 波长处有很强吸收峰。
所以你看到说明书里说：
“在 450 nm 处测定吸光度 A450，反映 O₂⁻ 与 WST-8 反应生成的甲臜量。”
简化理解：
- O₂⁻ 越多 → WST-8 被还原得越多 → 450 nm 吸光度越高。
3. 加入样本中的 SOD，去“抢” O₂⁻
当你把样本（含 SOD）加入该体系时：
- SOD 把 O₂⁻ 迅速转成 H₂O₂ 和 O₂；
- 留给 WST-8 的 O₂⁻ 就变少了；
- 结果就是：450 nm 的吸光度会变低。
因此，在 WST-8 微量法中可以简单记住一条：
同一条件下，样本的 A450 越低 → 抑制率越高 → SOD 活性越强。
四、450 nm 吸光度是怎么变成 SOD 活性的？
理解原理时，不需要把公式背得滚瓜烂熟，只要抓住几个关键概念：
1. 空白 vs 样本：先算“净信号”
板上通常会设几种孔：
- 空白孔（Blank）：只含底物、XO、WST-8 等，不加样本 → 代表“100% 反应”；
- 空白对照孔：无 XO，只看底液和 WST-8 本底；
- 样本孔（Sample）：加了样本 + XO + WST-8 → 有 SOD 参与竞争；
- 样本对照孔：无 XO，只看样本本身颜色。
先分别做本底校正：
- ΔA（空白） = A（空白孔） − A（空白对照孔）
- ΔA（样本） = A（样本孔） − A（样本对照孔）
2. 抑制率：SOD 把反应“压下去”的程度
有了 ΔA 之后，就可以算出抑制率：
抑制率（%） = [ΔA（空白） − ΔA（样本）] ÷ ΔA（空白） × 100
理解成：
- ΔA（空白） 是“没有 SOD 时，O₂⁻ 全部跑去还原 WST-8 的信号”；
- ΔA（样本） 是“有 SOD 抢了一部分 O₂⁻ 后，剩下的 O₂⁻ 还能还原 WST-8 的信号”；
- 两者之差 / ΔA（空白），就是样本中 SOD 把反应“截胡”的百分比。
3. 从抑制率到“U”的约定
在 XO–WST-8 体系中，一般约定：
- 当抑制率为 50% 时，定义体系内的 SOD 活性为 1 U/mL；
- 再根据样本体积、稀释倍数、蛋白浓度等，把它换算成 U/g、U/mL、U/mgprot 等不同单位。
所以，450 nm 的 A 值 → ΔA → 抑制率 → U，这条链路都是基于同一条原理：
“O₂⁻ 被 SOD 抢走多少，就让 WST-8 少显色多少。”
五、为什么 WST-8 微量法更适合 96 孔板高通量？
很多人从 NBT 法或 TBA 法转到 WST-8 微量法，直观感受就是三个词：干净、省事、好用。
1. 水溶性强，不用搞有机萃取
- WST-8 及其生成的甲臜都是水溶性，
- 不需要氯仿、丁醇等有机溶剂萃取，操作更安全，也更适合常规细胞 / 组织平台。
2. 信号稳定，适配酶标仪
- 产物在 450 nm 有清晰吸收峰；
- 通常在一定孵育时间内信号比较稳定，衰减不快；
- 配合 96 孔板，一板同时读几十个样本没压力。
3. 体系体积小，适合“微量”样本
- WST-8 法通常每孔体系在 200 μL 左右甚至更低；
- 对于珍贵样本（小鼠某个脑区、微量血清）来说，样本消耗压力比较小。
4. 易于方法统一
当 SOD、MDA 等多个指标都采用微量比色法时：
- 孵育温度、时间、读板波长大多在同一水平；
- 操作习惯统一，更方便安排人员和时间；
- 数据形式统一，也方便后续做统计和绘图。
这也是为什么很多品牌（包括 CheKine™）会把 SOD、MDA、CAT、POD 等氧化应激指标都做成微量比色法系列，方便用户“一套体系搞定一串指标”。
六、以 CheKine™ WST-8 法 SOD 试剂盒为例，看原理如何落到试剂盒设计
理解了上面的通路，再看一眼典型 WST-8 法 SOD kit（比如 CheKine™ 超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（微量法）），就很好对上号了：
- Assay Buffer（反应缓冲液）
- 提供适合 XO 和 SOD 活动的 pH 与离子环境，是整个体系的“背景舞台”。
- Xanthine / Xanthine Oxidase
- 固定的底物和酶对，负责持续产生 O₂⁻，确保显色反应有稳定的“燃料”。
- WST-8 + Enhancer
- WST-8 负责与 O₂⁻ 反应生成带色产物；
- Enhancer 增强信号强度和稳定性，让 450 nm 的读数更干净。
- Lysis Buffer / Sample Diluent
- Lysis Buffer 用于样本裂解、释放细胞内 SOD；
- Sample Diluent 用于样本稀释、酶 / 底物配置，保证不同孔体系一致。
- 96 孔板读数（450 nm）
- 体系最终读出的是水溶性甲臜在 450 nm 的吸光度；
- 通过空白、样本对照、抑制率的计算，反推出样本中的 SOD 活性。
对用户来说，这样一套 kit 基本上把整条原理链路“封装”好了：
你只需要按说明书准备样本、配好试剂、按照步骤孵育和读板，
背后 XO–O₂⁻–WST-8–SOD 这条反应链，自然在每个孔里跑完一遍。
七、小结：记住这三句话，WST-8 SOD 原理就通了
如果你希望用最短的话把 WST-8 法 SOD 活性测定原理讲给组里的人听，可以概括为三句：
- 先用黄嘌呤 / 黄嘌呤氧化酶体系持续产生 O₂⁻。
- 用 WST-8 把 O₂⁻ 的多少转成 450 nm 的显色深浅。
- 让样本中的 SOD 抢 O₂⁻，显色被抑制的程度（抑制率），就是 SOD 活性的“影子”。
在这个框架下，再去看任何一款 WST-8 微量法 SOD 试剂盒（尤其是像 CheKine™ 这种已经把 XO、WST-8、Enhancer、缓冲体系配好的一站式 kit）， 你都会更清楚：每一瓶试剂、每一个孔，其实都在服务这条“从 O₂⁻ 到 450 nm 吸光度”的反应链。
