SOD活性检测步骤实战手记：血清、组织、细胞一篇搞定

默认前提：你在用的是一款WST-8 微量法 SOD 试剂盒，比如CheKine™ 超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（微量法），

下面所有步骤都按这种体系来写。

整套 SOD 活性检测，说白了就三件事：

1. 样本怎么处理得既不“脏”，又留住 SOD 活性；
2. 板子怎么排、试剂怎么配，才能稳稳在线性范围；
3. 读完板之后，怎么算、怎么记，后期画图不至于抓狂。

这篇就按样本类型分三块：血清 / 血浆 → 动物 / 植物组织 → 细胞 / 细菌，

一步步把 SOD 活性检测步骤写成“实验手记版”。

一、上机前的几个共通习惯（强烈建议先统一）

无论你测的是血清、组织还是细胞，用 WST-8 法 SOD kit 有几个“底层习惯”很重要：

• 所有样本制备尽量全程冰上：

  匀浆、超声、离心之间别在室温放太久，尤其是夏天。

• 试剂开盖前先轻轻离心一下：

  把挂在瓶壁的液体甩回瓶底，尤其是 XO、WST-8、增强剂这些关键组分。

• 用前回温到说明书要求的温度（一般是室温 20–25℃）：

  冷得发抖的黄嘌呤工作液、WST-8 经常会看起来有点混浊，

  回温 + 涡旋，混匀就好。

• 工作液一次性配足：

  不要这板配一半、那板再配一半，很容易孔与孔之间出现体系浓度差。

• 尽量用多通道枪加样：

  特别是 SOD 反应体系这一步，多通道从左到右“一扫”，孵育时间才好统一。

只要这几条习惯先立住，后面无论什么样本，SOD 活性检测的稳定性都会好很多。

二、血清 / 血浆 SOD 活性检测操作步骤

关键词：“血清 SOD 活性 检测 步骤”、“SOD 活性检测 步骤”

1. 血清 / 血浆样本准备

采血 & 分离（简单版 SOP）：

• 动物禁食 8–12 h（按课题需要），常规方式取血；
• 做血清：自然凝固 30 min 左右，3000 rpm，10 min，取上清即血清；
• 做血浆：预置抗凝管（EDTA / 肝素），3000 rpm，10 min，取上清即血浆；
• 分装成小管，短期 4℃，需长期保存建议 −80℃，避免反复冻融。

小提示：

• 尽量避免严重溶血、严重脂血样本，都会增加背景；
• 已经溶血的样本，建议在实验记录里单独标记，统计分析时心里有数。

2. 上机前准备

2.1 试剂准备（以 CheKine™ SOD kit 为例）

• 从 −20℃ 冰箱取出试剂盒，需要用到的组分

  （Assay Buffer、Sample Diluent、5×Lysis Buffer 可忽略，血清不用裂解；WST-8、Enhancer、黄嘌呤、XO 等）

  放在室温回温至 20–25℃；

• 轻轻离心，涡旋混匀黄嘌呤、WST-8 等易分层组分；

• 按说明书配制：

• 工作液（Working Solution）：Assay Buffer + 黄嘌呤 + WST-8 + Enhancer 等
• XO 工作液：XO 按推荐稀释倍数现配

具体体积和比例以当批说明书为准，建议直接在本子上记一行：

“今天这板：工作液总配 XXX mL，可跑 XX 孔，预留 10% 冗余”。

2.2 血清 / 血浆上样稀释

• 按说明书建议倍数，用 Sample Diluent 先把血清 / 血浆预稀释一遍；
• 第一次做可以粗暴一点：
• 直接设计两个稀释倍数（比如 1:10、1:20），看哪一个抑制率落在 10–90% 区间；
• 以后就固定用这一个倍数。

3. 排板：以 WST-8 法为例的一般结构

在 96 孔板上安排好：

• 空白（Blank）：工作液 + XO（无样本），通常做 2 孔
• 空白对照（Blank Control）：工作液（无 XO，无样本），2 孔
• 样本孔（Sample）：样本 + 工作液 + XO，每个样本 2 孔复孔
• 样本对照孔（Sample Control）：样本 + 工作液（无 XO），每个样本 1–2 孔

排板习惯：

• 每一行尽量只放同一组处理（对照组一行、模型组一行、给药组一行……）；

• 同一只动物 / 同一个病人，Sample 和 Sample Control 放在相邻孔，

  后面算 ΔA 时不会对错。

4. 加样、孵育、读板

1. 按排板表顺序依次加入：

• Sample / Sample Control 孔：先加样本；
• 再加工作液；
• 最后统一加 XO（样本对照孔不加 XO）。

2. 轻轻拍板或短暂离心，让各孔液体充分混匀、无气泡。

3. 放入恒温箱或酶标仪内孵育，按说明书推荐温度和时间

   （常见设置：37℃ 或 25℃，约 20–30 min）。

4. 孵育结束后，在450 nm 读板，记录各孔 A 值。

5. 血清 / 血浆常见小坑

• 抑制率接近 100%：

  → 过稀释或样本 SOD 活性过高，下一板把稀释倍数放大一点。

• 抑制率接近 0%：

  → 样本活性过低，或冻存 / 预处理不当，先检查操作，再尝试减小稀释倍数。

• 背景偏高：

  → 可能是样本颜色深 / 指甲油 / 溶血等因素干扰，

  这时样本对照孔的重要性就体现出来了，一定要扣除本底再算。

三、动物 / 植物组织 SOD 活性测定 SOP

关键词：“SOD 活性检测 步骤”、“植物 SOD 活性 测定”

这部分是绝大多数氧化应激课题的“主战场”： 高脂饮食、药物性肝损伤、缺血再灌注、肾毒性、肺损伤…… 基本都是：各种组织匀浆 + SOD 活性测定。

1. 取材与称重

• 动物处死后尽快取材，剪去多余脂肪、血块；
• 用预冷 PBS 快速冲洗表面血迹，吸干表面液体；
• 称重，一般建议按 10% 匀浆的思路准备：
• 例：0.1 g 组织 + 0.9 mL 裂解液；
• 植物组织同理，只是纤维多，匀浆要更耐心。

小习惯：称重时顺手在本子上写好“组织类型–重量–对应裂解液体积”，

后面算 SOD 活性（U/g）时非常好用。

2. 匀浆 / 裂解

动物组织：

• 加入预冷的裂解液（CheKine™ kit 会提供 5×Lysis Buffer，按说明书稀释好再用）；
• 置于冰浴，采用玻璃匀浆器、机械匀浆器或超声仪匀浆：
• 机械匀浆：低速起步，逐渐升速，避免产生大量泡沫；
• 超声：间断超声（如 3 s 超声 / 5 s 间隔），避免温度升高太快；
• 匀浆液冰上静置几分钟，给酶“缓一口气”。

植物组织：

• 建议用预冷研钵 + 液氮 / 预冷匀浆器先打碎组织；

• 再加入裂解液继续匀浆；

• 有些植物含大量色素、多酚，多半本底会偏高，

  后面一定要重视样本对照孔。

3. 离心与取上清

• 4℃ 低温离心，10000–12000 g，10–15 min（具体按说明书）；
• 取上清，尽量不要扰动底部沉淀；
• 上清即为待测样本，可按需要做蛋白定量、再分装、短期置冰上。

如果暂时不能立即上机：

• 建议分装后 −80℃ 保存；

• 不要每天拿出来“看一眼”又冻回去，

  一次解冻就完成所有相关检测。

4. 上板步骤与血清基本一致

后面的逻辑与血清类似：

1. 按照预估的 SOD 活性，

   先做一板小范围预实验，试 2–3 个稀释倍数；

2. 确认哪个稀释倍数能让抑制率稳定落在 10–90% 后，

   后面所有组织样本都尽量用这一套条件；

3. 排板：空白、空白对照、样本、样本对照按前文结构安排；

4. 加样 → 加工作液 → 加 XO → 孵育 → 450 nm 读板。

5. 组织样本的几个注意事项

• 脂肪多的组织（如白脂肪、部分肝样本）：

  匀浆后上清可能油花明显，

  建议多离心一次，尽量只取中间清亮液层。

• 铁含量高、含血量大的组织（如脾脏）：

  容易颜色偏深，本底偏高，

  要求样本对照孔、空白对照孔一定要齐全。

• 植物叶片、根皮等色素重的样本：

  可以适当提高稀释倍数，

  或在匀浆步骤后增加简单过滤（纱布 / 滤网），

  降低浑浊和杂质对读数的影响。

四、细胞与细菌样本的 SOD 活性检测步骤

关键词：“SOD 活性检测 步骤”、“细胞 SOD 活性 检测”

这部分更多出现在机制研究、体外模型里。

如果你想让“体内 + 体外”两条线的数据统一风格，

用同一套 WST-8 法 SOD kit 是比较舒服的选择。

1. 细胞样本准备

贴壁细胞：

1. 接种、处理（药物、过表达、siRNA 等）到设定时间；

2. 弃培养液，用 PBS 轻轻洗涤 1–2 次；

3. 加入少量 PBS 或裂解液，刮下细胞，收集至离心管；

4. 计数（可选，但强烈推荐），

   一般习惯以**(1–5)×10⁶ cells / 管** 为一个检测单位。

悬浮细胞：

1. 直接收集细胞悬液；
2. 低速离心（如 1000–1500 g，5 min），弃上清；
3. PBS 洗 1–2 次；
4. 计数后加入裂解液。

2. 细胞裂解

• 加入预冷裂解液（按说明书体积建议，一般 10⁶ cells 可加 100–200 μL）；
• 冰浴超声破碎：间断式，避免温度升高；
• 4℃ 离心（如 10000–12000 g，10 min）；
• 取上清作为 SOD 待测样本。

如果同时要做蛋白定量、其他酶活，可以分成几份上清分别使用。

3. 细菌样本准备与裂解

细菌样本（例如 E.coli 模型）：

1. 取对数生长期细菌培养液；
2. 适当体积离心收集菌体（如 4000–6000 g，10 min）；
3. PBS 洗 1–2 次；
4. 加入裂解液重悬，冰浴超声破碎（细菌细胞壁较厚，超声时间一般略长）；
5. 4℃ 离心，取上清用于检测。

4. 上板与读板

后续操作与前文完全一样：

• 按预估活性（细胞 / 细菌一般 SOD 活性不算特别夸张），

  先尝试 1–2 个稀释倍数做小预实验；

• 按确定好的稀释倍数大规模排板；

• 空白、空白对照、样本、样本对照齐备；

• 工作液一锅配好，多通道加样、孵育、450 nm 读板。

五、四类样本共通的“算账习惯”（简版）

SOD 活性计算的细节可以单独写一篇，

这里只留一个“简化版记忆模板”，方便你在本子上直接照抄：

1. 先算 ΔA：

• ΔA（空白） = A（空白孔） − A（空白对照孔）
• ΔA（样本） = A（样本孔） − A（样本对照孔）

1. 再算抑制率：

抑制率（%） = [ΔA（空白） − ΔA（样本）] ÷ ΔA（空白） × 100

1. 最后按说明书公式换算成 SOD 活性（U/g、U/mL、U/mgprot 或 U/10⁴ cells）：

• 用样本质量（g）、体积（mL）、蛋白浓度（mg/mL）代入即可。

如果你用的是 CheKine™ SOD kit，可以直接用配套 Excel 模板：

把原始 A 值和必要参数填进去，抑制率和 SOD 活性会自动算好。

六、建议的“实验记录小模板”

无论是血清、组织还是细胞，建议在实验记录本里固定一个格式，例如：

• 样本编号 / 组别
• 样本类型（血清 / 肝 / 肾 / 细胞系名称等）
• 前处理参数（质量、体积、裂解条件、离心条件）
• 稀释倍数
• 孔位（A1、A2…）
• A 值、ΔA、抑制率
• 最终 SOD 活性（单位写清楚：U/g、U/mL、U/mgprot 等）

这样做的好处是：

哪怕半年后再回看，也能知道当时到底怎么做的，

文章返修、补图、补实验时，心里都不慌。

七、最后一句话

如果你手里已经有一套WST-8 微量法SOD试剂盒（例如 CheKine™ SOD kit），

基本可以按这篇“实验手记”的结构，把你们自己实验室的 SOP 填进去：

• 血清 / 血浆按第 2 部分调整；
• 动物 / 植物组织按第 3 部分调整；
• 细胞 / 细菌按第 4 部分调整；

然后再把说明书里的细节（具体体积、孵育时间、离心条件）补全， 就是一套适合你们课题组的、稳定可复现的SOD 活性检测标准流程。