30分钟搭好一套ROS荧光检测:DCFH-DA细胞实验标准流程(流式/显微通用)

很多人第一次做细胞ROS，都是对着说明书一点点抠：

• DCFH-DA 到底配多少？
• 阳性对照 H₂O₂ 用多大浓度？
• 贴壁细胞和悬浮细胞操作是不是不一样？
• 做完之后，是先上显微，还是直接上流式？

这篇就做一件事：

给你一套可以直接照抄的 DCFH-DA 细胞ROS实验标准流程， 用的是基于 DCFH-DA 的ROS试剂盒体系， 一次搭好流程，流式 + 荧光显微两种读数方式都能用。

一、这套 SOP 适用什么场景？

• 样本类型：各种培养细胞（贴壁、悬浮都可以）
• 检测指标：细胞内总体 ROS 水平（总氧化水平 readout）
• 探针：DCFH-DA（10 mM 储备液），细胞内被 ROS 氧化后发出绿色荧光（FITC 通道）
• 仪器：
• 荧光显微镜（带 FITC 滤光片）
• 流式细胞仪（Ex 488 nm / Em 525 nm）

只要你的核心问题是：

“这组处理会不会显著升高细胞 ROS？”

这套流程就够用。

二、10 分钟完成试剂准备：三个核心工作液

1. DCFH-DA 工作液

• 探针一般以10 mM 储备液形式提供，-20 ℃ 避光保存。
• 实验当天临用前，用无血清培养液稀释到：
• 终浓度 10 μM 作为标准起始条件。

小记：10 μM 是一个比较“万金油”的起点。

如果发现背景偏高，后面可以把终浓度往下调到 2–5 μM。

2. H₂O₂ 阳性对照工作液

• H₂O₂ 阳性对照一般以高浓度储备液形式提供（例如 50 mM），4 ℃ 避光保存。
• 当天现配，用无血清培养液稀释到：
• 50 μM 作为推荐起始浓度（常用区间可在 50–250 μM 之间调整）。

只加在阳性对照孔 / 管中，其他实验组不用加。

如果阳性对照不够亮，可以把终浓度往 100–200 μM 调，或者延长刺激时间到 1–4 h。

3. 待测试剂 / 刺激物

• 按课题设计，用无血清培养基稀释成所需浓度即可。

三、两种装载方式：原位装载 vs 悬液装载

你只要记住一句话：

贴壁细胞想直接在板上看显微 →原位装载探针； 悬浮细胞 / 以后要做流式 →收集细胞后装载探针。

3.1 原位装载探针（适合贴壁细胞 + 显微观察）

适用： 已经铺在 6 孔板 / 24 孔板里的贴壁细胞。

步骤：

1. 细胞铺板
• 检测前一天按合适密度铺板，保证检测时细胞处于对数生长期；
• 一般建议检测时细胞密度 < 5×10⁵ 个/mL，避免过度融合。
2. 药物诱导（实验处理组）

• 去掉旧培养基，加入

  无血清培养液 + 待测试剂，在 37 ℃ 细胞培养箱内避光孵育；

• 刺激时间按药物和细胞特性自行设定。

3. 阳性对照（强烈建议有一组）
• 阳性孔：加入稀释好的 H₂O₂ 工作液（终浓度从 50 μM 起步），
• 37 ℃ 避光孵育 30 min–4 h；
• 对常见细胞系（如 HeLa）来说，30–60 min 通常就能看到明显的 ROS 升高。
4. 准备 DCFH-DA 工作液
• 用无血清培养基把 DCFH-DA 稀释到终浓度 10 μM。
5. 探针原位装载
• 6 孔板：每孔建议 ≥ 1 mL
• 96 孔板：每孔建议 ≥ 100 μL
• 去掉孔内药物；
• 用无血清培养液轻轻洗细胞 1–2 次；
• 加入足量 DCFH-DA 工作液完全覆盖细胞：
• 37 ℃ 细胞培养箱内避光孵育30 min。
6. 洗掉未进入细胞的探针
• 用无血清培养基洗细胞 1–2 次，
• 尽量彻底去掉游离 DCFH-DA，降低背景。

到这一步为止，贴壁细胞已经完成探针装载，可以：

• 直接在板上看显微，
• 或者消化成单细胞后上流式。

3.2 收集细胞后装载探针（适合悬浮细胞 / 准备上流式）

适用：

• 各种悬浮细胞；
• 贴壁细胞消化后做流式分析。

步骤：

1. 收集细胞
• 贴壁细胞：PBS 洗一次 → 胰酶消化 → 加含血清培养基终止 → 收集细胞离心；
• 悬浮细胞：直接离心收集即可。
2. 药物诱导 / 阳性对照
• 用无血清培养基重悬细胞，
• 加入待测药物，在 37 ℃ 避光孵育，时间按课题设定；
• 阳性对照组加入终浓度 50 μM H₂O₂，37 ℃ 避光孵育 30–60 min（必要时可延长到 30 min–4 h）。
3. 准备 DCFH-DA 工作液
• 同样稀释到终浓度10 μM。
4. 悬液装载探针
• 刺激结束后离心去掉药物，上清弃掉；
• 用无血清培养基洗细胞 1–2 次；
• 用 DCFH-DA 工作液重悬细胞，使细胞密度约为1×10⁶–2×10⁷ 个/mL；
• 37 ℃ 细胞培养箱内避光孵育30 min。
5. 再次清洗
• 孵育结束后，用无血清培养基再洗 1–2 次；
• 去除残留探针，避免流式背景过高。

至此，你手里拿到的就是一管“装好探针、处理完毕”的细胞悬液，可以直接：

• 滴片 → 看荧光显微；
• 或 PBS 重悬到合适浓度 → 上流式。

四、显微 vs 流式：一条流程，两个出口

4.1 荧光显微镜读数（适合看形态 + 粗定量）

贴壁细胞：

1. 按原位装载流程完成装载 + 清洗；
2. 每孔加少量无血清培养基或 PBS，防止细胞晾干；
3. 上荧光显微镜，选用FITC 滤光片（Ex ~488 nm / Em ~525 nm）；
4. 在完全相同的曝光条件下依次拍摄对照组、处理组、阳性对照组。

悬浮细胞：

1. 按“收集后装载探针”的流程做到清洗结束；
2. 取 25–50 μL 细胞悬液滴在载玻片上，盖盖玻片；
3. 同样用 FITC 通道拍照、对比荧光强度。

小提示： 读片时曝光时间越短越好，在不影响成像质量的前提下尽量压低曝光。 更重要的是，所有组的曝光时间必须一致，否则无法直接比较强度。

4.2 流式细胞仪读数（适合定量比较）

1. 制备单细胞悬液
• 贴壁细胞：按原位装载完成后，用胰酶消化成单细胞，再收集；
• 悬浮细胞：按悬液装载流程结束后直接收集。
2. PBS 重悬
• 用 PBS 重悬细胞，调整浓度到0.5–1×10⁵ 个/mL 左右。
3. 上机设置
• 激发：488 nm
• 发射：约 525 nm（FITC 通道）
• 至少采集 1–2 万个细胞事件；
• 用 FSC/SSC 先把碎片、死细胞排除掉，再看 FITC 信号分布。
4. 结果解读
• 对比阴性对照 vs 处理组 / 阳性对照的平均荧光强度（MFI）；
• 或者比较阳性细胞比例的变化。

五、时间轴大概长什么样？“30 分钟搭好”的含义

如果你的细胞模型和药物刺激时间已经确定好了，那么真正从：

“配好工作液 → 装载探针 → 洗涤 → 上机读数”

这一段流程，大概是这样的（不包括药物诱导时长）：

• 试剂准备：

• DCFH-DA 稀释到 10 μM

• H₂O₂ 稀释到 50 μM