前列腺素E2 ELISA定量试剂盒-EliKine™

自备耗材

• 酶标仪（能测450 nm处的吸光度）
• 多通道移液器或自动洗板机
• 恒温箱、低温离心机
• 可调节式移液枪及枪头
• 去离子水

酶标仪（能测450 nm处的吸光度）

多通道移液器或自动洗板机

恒温箱、低温离心机

可调节式移液枪及枪头

去离子水

试剂准备

1×Assay Buffer：使用前，平衡到室温，用去离子水按1:10的比例稀释Assay Buffer (10×)得到1×Assay buffer，轻轻混合以避免起泡。4℃保存，此溶液可稳定保存30天。1×Assay buffer用于稀释标准品、血清和血浆样品，PGE2 Antibody (50×)、Biotin Conjugated PGE2 (100×)和Streptavidin-HRP (100×)。

1×Assay Buffer：

1×PGE2 Antibody：加入PGE2 Antibody (lyophilized)的标签上标注重悬体积的无菌水复溶得到PGE2 Antibody (50×)，稀释前充分混合，PGE2 Antibody (50×)可在-20℃保存1个月。根据标准品和样品所需要的量，在干净的塑料管中用1×Assay buffer对PGE2 Antibody（50×）进行1:50稀释。1×PGE2 Antibody应在稀释后30 min内使用。

1×PGE2 Antibody：

PGE2 Standard: 加入标准品的标签上标注重悬体积的无菌水复溶PGE2 Standard得到4,000 pg/mL标准品。在进行稀释之前，将标准品至少放置15 min并轻轻晃动，复溶后Standard可在-20℃保存1个月，重溶使用1次后丢弃。

PGE2 Standard:

1×Biotin Conjugated PGE2：稀释前充分混合。根据标准品和样品所需要的量，在干净的塑料管中用1×Assay buffer对Biotin Conjugated PGE2 (100×)进行1:100稀释。1×Biotin Conjugated PGE2应在稀释后30 min内使用。

1×Biotin Conjugated PGE2：

1×Streptavidin-HRP：加入Streptavidin-HRP (lyophilized)的标签上标注重悬体积的无菌水复溶得到Streptavidin-HRP (100×)，稀释前充分混合，Streptavidin-HRP (100×)可在-20℃保存1个月。根据标准品和样品所需要的量，在干净的塑料管中用1×Assay buffer对Streptavidin-HRP（100×）进行1:100稀释。1×Streptavidin-HRP应在30 min内使用。

1×Streptavidin-HRP：

HRP Substrate（TMB）：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

HRP Substrate（TMB）：

Stop Solution：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Stop Solution：

1×Wash Buffer: 使用前平衡到室温，用去离子水进行1:20稀释得到1×Wash buffer。轻轻混合以避免起泡，室温保存，此溶液可稳定保存30天。

1×Wash Buffer:

标准曲线设置

按下表所示，用1×Assay Buffer将4,000 pg/mL标准品稀释为2,000、1,000、500、250、125、62.5、31.25和15.63 pg/mL的PGE2标准品。

序号	标准品体积	1×Assay Buffer体积 (μL)	标准品浓度（pg/mL）
Std.1	230 μL of 4,000 pg/mL	230	2,000
Std.2	230 μL of Std.1 (2,000 pg/mL)	230	1,000
Std.3	230 μL of Std.2 (1,000 pg/mL)	230	500
Std.4	230 μL of Std.3 (500 pg/mL)	230	250
Std.5	230 μL of Std.4 (250 pg/mL)	230	125
Std.6	230 μL of Std.5 (125 pg/mL)	230	62.5
Std.7	230 μL of Std.6 (62.5 pg/mL)	230	31.25
Std.8	230 μL of Std.7 (31.25 pg/mL)	230	15.63

序号标准品体积1×Assay Buffer体积 (μL)标准品浓度（pg/mL）序号标准品体积1×Assay Buffer体积 (μL)标准品浓度（pg/mL）序号标准品体积1×Assay Buffer体积 (μL)标准品浓度（pg/mL）Std.1230 μL of 4,000 pg/mL2302,000Std.2230 μL of Std.1 (2,000 pg/mL)2301,000Std.3230 μL of Std.2 (1,000 pg/mL)230500Std.4230 μL of Std.3 (500 pg/mL)230250Std.5230 μL of Std.4 (250 pg/mL)230125Std.6230 μL of Std.5 (125 pg/mL)23062.5Std.7230 μL of Std.6 (62.5 pg/mL)23031.25Std.8230 μL of Std.7 (31.25 pg/mL)23015.63Std.1230 μL of 4,000 pg/mL2302,000Std.1230 μL of 4,000 pg/mL2302,000Std.2230 μL of Std.1 (2,000 pg/mL)2301,000Std.2230 μL of Std.1 (2,000 pg/mL)2301,000Std.3230 μL of Std.2 (1,000 pg/mL)230500Std.3230 μL of Std.2 (1,000 pg/mL)230500Std.4230 μL of Std.3 (500 pg/mL)230250Std.4230 μL of Std.3 (500 pg/mL)230250Std.5230 μL of Std.4 (250 pg/mL)230125Std.5230 μL of Std.4 (250 pg/mL)230125Std.6230 μL of Std.5 (125 pg/mL)23062.5Std.6230 μL of Std.5 (125 pg/mL)23062.5Std.7230 μL of Std.6 (62.5 pg/mL)23031.25Std.7230 μL of Std.6 (62.5 pg/mL)23031.25Std.8230 μL of Std.7 (31.25 pg/mL)23015.63Std.8230 μL of Std.7 (31.25 pg/mL)23015.63

注意：每次实验都需要新配制标准品。

注意：

反应板设置

每块板或每批酶标条都须至少包含2个空白孔、2非特异结合孔（NSB）、2个最大结合孔（B0）以及2条包含8个点的标准曲线。

注意：为了确保准确、可重复的结果，每次检测都须包含以上设置。每个样本应做两个梯度的稀释，每个梯度做2次重复。为了统计的目的，我们建议每个样本做3次重复。推荐的反应板设置和加样汇总如下所示。实验者可根据具体实验，更改孔的位置和类型。

注意：

孔类型	1×Assay Buffer (μL)	1×PGE2 Antibody (μL)	标准品 (μL)	样本 (μL)	1×Biotin Conjugated PGE2 (μL)	1×Streptavidin-HRP (μL)
空白孔	—	—	—	—	—	—
非特异结合孔（NSB）	50+100	—	—	—	50	100
最大结合孔（B0）	100	50	—	—	50	100
偶联物总酶活孔（TA）	—	—	—	—	—	1（加TMB前）
标准品孔	—	50	100	—	50	100
样本孔	—	50	100	50	100	—

孔类型1×Assay Buffer (μL)1×PGE2 Antibody (μL)标准品 (μL)样本 (μL)1×Biotin Conjugated PGE2 (μL)1×Streptavidin-HRP (μL)孔类型1×Assay Buffer (μL)1×PGE2 Antibody (μL)标准品 (μL)样本 (μL)1×Biotin Conjugated PGE2 (μL)1×Streptavidin-HRP (μL)孔类型1×Assay Buffer (μL)1×PGE2 Antibody (μL)标准品 (μL)样本 (μL)1×Biotin Conjugated PGE2 (μL)1×Streptavidin-HRP (μL)空白孔——————非特异结合孔（NSB）50+100———50100最大结合孔（B0）10050——50100偶联物总酶活孔（TA）—————1（加TMB前）标准品孔—50100—50100样本孔—5010050100—空白孔——————空白孔——————非特异结合孔（NSB）50+100———50100非特异结合孔（NSB）50+100———50100最大结合孔（B0）10050——50100最大结合孔（B0）10050——50100偶联物总酶活孔（TA）—————1（加TMB前）偶联物总酶活孔（TA）—————1（加TMB前）标准品孔—50100—50100标准品孔—50100—50100样本孔—5010050100—样本孔—5010050100—

样本制备

1. 细胞培养上清：离心除去颗粒，立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。
2. 血清：使用血清分离管，让样品在室温下凝结30 min，然后1,000 g离心15 min。取上层血清立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。
3. 血浆：使用EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝剂收集血浆。在收集后30 min内1,000 g离心15 min。立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。

细胞培养上清：离心除去颗粒，立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。

细胞培养上清：

血清：使用血清分离管，让样品在室温下凝结30 min，然后1,000 g离心15 min。取上层血清立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。

血清：

血浆：使用EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝剂收集血浆。在收集后30 min内1,000 g离心15 min。立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。

血浆：

正常血清血浆样本需要200倍稀释。推荐5 μL样本+995 μL 1×Assay Buffer。

正常血清血浆样本需要200倍稀释。

注意：不要使用严重溶血或脂血的标本。如果样品要在24 h内使用，则可以将其储存在2至8℃，避免反复冻融。测定前，应将冷冻样品缓慢升至室温并轻轻混合。为了抑制COX-2合成前列腺素，应在提取后立即将吲哚美辛加入血清和血浆收集管中（最终浓度约为10 μg/mL）。

注意：

实验步骤

1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.

注意：5-30 min显色时间为经验范围，每个具体的实验，可根据以下情况，确定大致的显色时间。

注意：

1. 肉眼观察：标曲S5孔有淡蓝色、Blank孔无明显蓝色时，即可终止；
2. 仪器判断：630 nm左右波长下，标曲S1孔的OD值达到0.5-0.7、S5孔的OD值达到0.05-0.08、Blank孔的OD值小于0.05时，即可终止。

肉眼观察：标曲S5孔有淡蓝色、Blank孔无明显蓝色时，即可终止；

仪器判断：630 nm左右波长下，标曲S1孔的OD值达到0.5-0.7、S5孔的OD值达到0.05-0.08、Blank孔的OD值小于0.05时，即可终止。

结果计算

1. 计算标准品和样本的平均OD值，然后减去NSB的OD值，标准品和样本的校准OD值除以B0的校准OD值，乘以100，计算得到%B/B0。
2. 标准曲线的绘制：将标曲中Std.1 -Std.8的%B/B0作为纵坐标，标准品PGE2浓度取对数后作为横坐标。选择最佳的曲线(如四参数)进行拟合。根据标准曲线，计算得到PGE2的浓度。

计算标准品和样本的平均OD值，然后减去NSB的OD值，标准品和样本的校准OD值除以B0的校准OD值，乘以100，计算得到%B/B0。

标准曲线的绘制：将标曲中Std.1 -Std.8的%B/B0作为纵坐标，标准品PGE2浓度取对数后作为横坐标。选择最佳的曲线(如四参数)进行拟合。根据标准曲线，计算得到PGE2的浓度。

注意：标曲的计算不需要用到Blank和TA孔的OD值。它们是作为反应体系的诊断工具。标准曲线最高浓度点的终浓度为2,000 pg/ml。如果样本按照说明书进行了稀释，最终的稀释倍数为200。如果样本进行了其它方式的稀释，计算样本浓度时请乘以相应的稀释倍数。

注意：