大鼠血管内皮生长因子 ELISA定量试剂盒-EliKine™

自备耗材

• 酶标仪（能测450 nm处的吸光度）
• 多通道移液器或自动洗板机
• 恒温箱、低温离心机
• 可调节式移液枪及枪头
• 去离子水

试剂准备

1. 1× Sample Diluent：使用前，平衡到室温，用去离子水按1:5比例稀释5× Sample Diluent得到1× Sample Diluent，轻轻混合以避免起泡。4℃保存，此溶液可稳定保存30天。1× Sample Diluent用于稀释标准品，血清和血浆样品。
2. 1× Assay Buffer：使用前，平衡到室温，用去离子水按1:5比例稀释5× Assay Buffer得到1× Assay Buffer，轻轻混合以避免起泡。4℃保存，此溶液可稳定保存30天。1× Assay Buffer用于稀释100× Rat VEGF Detect Antibody和100× Streptavidin-HRP。
3. Rat VEGF Standard：加入1 mL 1× Sample Diluent复溶得到1,000 pg/mL标准品。在进行稀释之前，将标准品至少放置15 min并轻轻晃动。
4. 1× Rat VEGF Detect Antibody：稀释前充分混合。根据标准品和样品所需要的量，在干净的塑料管中用1× Assay Buffer对100× Rat VEGF Detect Antibody（1:100）进行稀释。稀释后应在30 min内使用。
5. 1× Streptavidin-HRP：稀释前充分混合。根据标准品和样品所需要的量，在干净的塑料管中用1× Assay Buffer对100× Streptavidin-HRP（1:100）进行稀释。稀释后应在30 min内使用。
6. HRP Substrate TMB：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
7. Stop Solution：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
8. 1× Wash Buffer：使用前平衡到室温，用去离子水进行1:20稀释得到1× Wash Buffer。轻轻混合以避免起泡，室温保存，此溶液可稳定保存30天。

标准曲线设置

按下表所示，用1× Sample Diluent将1,000 pg/mL标准品稀释为1,000、500、250、125、62.5、31.25、15.6和0 pg/mL Rat VEGF的标准品。

注意：每次实验都需要新配制标准品。

样本制备

1. 细胞培养上清：离心除去颗粒（1,000 g, 15 min），立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。
2. 血清：使用血清分离管，让样品在室温下凝结30 min，然后1,000 g离心15 min。取上层血清立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。
3. 血浆：使用EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝剂收集血浆。在收集后30 min内1,000 g离心15 min。立即测定或分装-20℃保存，避免反复冻融。

注意：不要使用严重溶血或脂血的标本。如果样品要在24 h内使用，则可以将其储存在2-8℃，避免反复冻融。测定前，应将冷冻样品缓慢升至室温并轻轻混合。

实验步骤

1. 从板框上取下多余的板条，将它们放回装有干燥剂包的铝箔袋中，然后重新密封。
2. 每孔加入100 μL稀释的标准品或样品。建议所有标准品和样品做复孔。给酶标板覆膜，在室温下孵育2 h。
3. 除去每孔中的液体并洗涤，重复该过程总共洗涤三次。使用多通道移液器或自动清洗机每孔加入250 μL 1× Wash Buffer进行洗涤，然后静置1-2 min。在每个步骤中完全去除液体对于获得良好性能至关重要。最后一次洗涤后，倒置酶标板并用干净的纸巾吸干以除去任何剩余的1× Wash Buffer。
4. 每孔加入100 μL稀释的1× Rat VEGF Detect Antibody。给酶标板覆膜，在室温下孵育1 h。
5. 重复步骤3中的洗涤。
6. 每孔加入100 μL稀释的1× Streptavidin-HRP。给酶标板覆膜，在室温下孵育30 min，注意避光。
7. 按照步骤3重复洗涤过程3-5次。
8. 每孔加入100 μL HRP Substrate TMB。给酶标板覆膜，并在室温下避光孵育15 min。
9. 每孔加入50 μL Stop Solution。Stop Solution应按照与TMB相同的顺序加到板中。孔中的颜色应从蓝色变为黄色。如果孔中的颜色为绿色或颜色变化不均匀，请轻轻敲击板以确保彻底混合。
10. 在30 min内，测定每孔450 nm处的吸光值。

结果计算

1. 计算每个标准品和样品的复孔平均OD值，并减去零浓度（Std.8）平均OD值。
2. 标准曲线的绘制：以标准品浓度为x轴，各标准品的平均吸光度为y轴，绘制标准曲线。可以使用作图软件来创建标准曲线。

注意：如果样品被稀释，从标准曲线读取的浓度必须乘以稀释系数。