糖原磷酸化酶b(GPb)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外光分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working Reagent：临用前配制；将 Reagent II 全部转移至 Reagent I 中，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

Working Reagent III：临用前配制；48 T加入 0.7 mL去离子水，96 T加入 1.4 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

Working Reagent IV：临用前配制；48 T加入 0.7 mL去离子水，96 T加入 1.4 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

Working Reagent V：临用前配制；48 T加入 0.35 mL去离子水，96 T加入 0.7 mL去离子水，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。Working Reagent V 为过饱和溶液，结晶未完全溶解为正常现象，不影响使用，加样前摇晃数次混匀。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细菌和细胞：收集 500万细菌或细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细菌或细胞 30次（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接检测。

注意：1. 如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。
2. 该试剂盒提取的样本也可以适用于 KTB1342的测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm，紫外光分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 96孔 UV板或微量石英比色皿中操作）：

3. 充分混匀，记录 340 nm处 10 s时吸光值 A1，37℃反应 10 min记录 610 s时的吸光值 A2。测定孔记为 A 测定，对照孔记为 A 对照。计算，ΔA 测定=A2 测定-A1 测定，ΔA 对照=A2 对照-A1 对照，ΔA=(A2 测定-A1 测定)-(A2 对照-A1 对照)。

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验，每个样本均需设置一个对照孔。如果ΔA小于 0.005可适当加大样本量。如果ΔA大于 0.6，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。若ΔA出现负值，则说明样本中不含 GPb或已降解。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

GPb活性的计算

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每毫克蛋白每分钟产生 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

总 GP (U/mg prot)=[ΔA 测定×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=643×ΔA 测定÷Cpr

GPa (U/mg prot)=[ΔA 对照×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=643×ΔA 对照÷Cpr

GPb (U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每克样本每分钟产生 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

总 GP (U/g 鲜重)=[ΔA 测定×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=643×ΔA÷W

GPa (U/g 鲜重)=[ΔA 对照×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=643×ΔA 对照÷W

GPb (U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=643×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞数量计算

酶活单位定义：每 10⁴细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

总 GP (U/10⁴)=[ΔA 测定×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(n×V 样÷V 样总)÷T=643×ΔA 测定÷n

GPa (U/10⁴)=[ΔA 对照×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(n×V 样÷V 样总)÷T=643×ΔA 对照÷n

GPb (U/10⁴)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(n×V 样÷V 样总)÷T=643×ΔA÷n

(4) 按样本体积计算

酶活单位定义：每毫升液体每分钟产生 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

总 GP (U/mL)＝[ΔA 测定×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样÷V 样总)÷T=643×ΔA 测定

GPa (U/mL)＝[ΔA 对照×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样÷V 样总)÷T=643×ΔA 对照

GPb (U/mL)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样÷V 样总)÷T=643×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L /mol /cm；d：96孔 UV板光径，0.5 cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；n：细菌或细胞数量，以万计。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d：0.5 cm调整为 d：1 cm进行计算即可。