丙酮酸激酶(PK)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 恒温箱、低温离心机
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Substrate Mix Working Reagent：临用前配制，48 T的 Substrate Mix瓶中加入 10.2 mL Assay Buffer和 0.6 mL去离子水充分溶解，在 96 T的 Substrate Mix瓶中加入 20.4 mL Assay Buffer和 1.2 mL去离子水充分溶解，溶解以后分装，-20℃可保存 6个月，避免反复冻融。

LDH Working Reagent：临用前配制，在 48 T的 LDH 中加入 0.6 mL去离子水充分混匀，在 96 T 的 LDH 中加入 1.2 mL去离子水充分混匀，稀释后 4℃可保存 1个月，冰上放置备用。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。该试剂盒提取的样本也可以适用于 KTB1251、KTB1341的测定。

实验步骤

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.005，可延长反应时间到 5 min或 10 min或者适当加大样本量。如果ΔA大于 1.0，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式如下

1. 血清（浆）中 PK活力的计算:

单位的定义：每 mL血清（浆）在反应体系中每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

2. 组织、细菌或细胞中 PK活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织在反应体系中每分钟消耗 1 nmol的 NADH 定义为一个酶活力单位。

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 10⁴个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗 1 nmol的 NADH 定义为一个酶活力单位。

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；10⁹：1 mol=1×10⁹ nmol；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；500：细菌或细胞总数，5×10⁶。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。