3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外光分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

注意：Extraction Buffer有毒且有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。

Working Reagent：临用前配制；将 Reagent II 全部转移至 ReagentⅠ瓶中，充分溶解。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，用匀浆器或研钵冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液待测。
2. 细胞或细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞或细菌，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液待测。
3. 培养液等液体样本：直接检测。

注意：1. 如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。

2. 该试剂盒提取的动植物组织、细胞的样本也适用于 KTB1331的测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm，紫外光分光光度计用去离子水调零。
2. Working Reagent置于 37℃预热 10 min。
3. 操作表（下述操作在 96孔 UV板或微量石英比色皿中操作）：

4. 迅速混匀，记录 340 nm处 10 s时吸光值 A1，37℃反应 5 min记录 310 s时的吸光值 A2。测定孔记为 A 测定，空白孔记为 A 空白，计算ΔA=(A1 测定-A2 测定)-(A1 空白-A2 空白)。

注意：空白管只需做 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.01可适当加大样本量。如果ΔA大于 0.6，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。若ΔA出现负值，则说明样本中不含 GAPDH或已降解。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

GAPDH活性的计算

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每毫克蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

(2) 按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每克样本每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

(3) 按细胞或细菌数量计算：

酶活单位定义：每 10⁴细胞或细菌每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

(4) 按液体体积计算：

酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

V 反总：反应体系总体积，0.2 mL=0.0002 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L /mol /cm；d：96孔板光径，0.5 cm；10⁹：1 mol=1×10⁹ nmol；V 样：加入样本体积，0.004 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；n：细胞或细菌数量，以万计。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d：0.5 cm调整为 d：1 cm进行计算即可。