应用指南 2026-10-29 阅读

LYS赖氨酸含量检测与肺纤维化氨基酸代谢研究：指标怎么选、怎么搭配

做肺纤维化代谢研究，氨基酸通常是需要关注的一类指标。

成纤维细胞向肌成纤维细胞分化时，会合成大量胶原等细胞外基质，需要消耗相应的氨基酸。其中，甘氨酸和脯氨酸是胶原的重要组成氨基酸，精氨酸也能作为底物参与谷氨酸、脯氨酸等分子的生成。因此，在研究肺纤维化相关的代谢变化时，研究人员往往会同时观察多种氨基酸的含量。

不过，实际做实验时会遇到几个问题：该检测哪些氨基酸？什么时候用质谱，什么时候用试剂盒？细胞和组织样本怎么分配？不同干预组的数据又该如何比较？

2025 年，Liu 等人在 Cellular and Molecular Life Sciences 发表了一项关于 circRNA 与肺纤维化的研究。研究人员先通过组学筛选差异代谢物，再利用商品化试剂盒验证，随后结合基因干预实验分析相关机制。

这项研究提供了一个可以参考的实验思路。下面结合论文中的检测设计，介绍 CheKine™ LYS赖氨酸含量检测试剂盒（微量法，货号 KTB1470）在肺纤维化研究中的应用，以及多指标检测时需要考虑的问题。

一、文献中的氨基酸代谢研究是怎么做的？

这项研究主要关注 circ0066187 如何促进成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。

论文介绍，特发性肺纤维化（IPF）的药物治疗仍存在局限。吡非尼酮和尼达尼布能够减缓用力肺活量下降，但无法逆转已经形成的纤维化。

与此同时，成纤维细胞的代谢异常与 TGF-β1 介导的促纤维化过程有关。研究人员因此将代谢组学和蛋白质组学结合起来，寻找可能参与肺纤维化的代谢通路。

整个实验主要包括四个阶段。

实验阶段	具体做法	主要材料或方法
模型建立	MRC-5 成纤维细胞使用 5 ng/mL TGF-β1 处理；小鼠气管内给予博来霉素（BLM）5 mg/kg，28 天后取材	细胞模型、小鼠模型
组学筛选	对 TGF-β1 处理 0、6、72 h 的细胞进行非靶向代谢组和蛋白组分析，寻找共同富集的通路	UHPLC-Q-TOF MS、LC-MS/MS
指标验证	从三条共同富集的通路中筛选 7 个差异代谢物和 6 个差异蛋白，在细胞和小鼠肺组织中检测	商品化检测试剂盒、Western blot
机制干预	敲低或过表达 circ0066187，使用 miR-29b-2-5p mimic 或 inhibitor，干预 STAT3，并开展回补实验	细胞转染、代谢物检测、蛋白检测

研究筛选出的 7 个差异代谢物分别为：

谷氨酰胺、脯氨酸、AMP、精氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和色氨酸。

其中，赖氨酸检测使用了 KTB1470。

赖氨酸在不同实验组中有什么变化？

论文报告，在 TGF-β1 处理的成纤维细胞和 BLM 小鼠肺组织中，赖氨酸含量均较对照组降低。

后续干预实验观察到以下变化：

circ0066187 干预： 敲低 circ0066187 后，赖氨酸升高；过表达后，赖氨酸降低。
miR-29b-2-5p 干预： 加入 mimic 后，赖氨酸升高；加入 inhibitor 后，赖氨酸降低。
STAT3 干预： 敲低 STAT3 后，赖氨酸升高；过表达 STAT3 后，赖氨酸降低。
回补实验： 相应的回补干预能够逆转上述变化。

结合其他代谢物、蛋白及细胞表型的实验结果，作者提出：circ0066187 可能通过吸附 miR-29b-2-5p，上调 STAT3，并经 STAT3 介导的代谢信号通路促进肺纤维化。

作者同时指出，相关代谢物和蛋白仍需要进一步开展临床样本相关性分析，以及功能和机制研究。

为什么先做质谱，再用试剂盒？

观察这项研究的实验流程，可以发现两类检测方法承担着不同任务。

非靶向代谢组学主要用于筛选。研究人员通过质谱分析，寻找模型中发生变化的代谢物，再结合蛋白组学结果筛选候选通路。

确定候选代谢物之后，研究进入多组验证阶段。此时需要在细胞、小鼠组织和不同干预组中反复检测相同指标，商品化试剂盒就可以用于这些后续实验。

这种安排也适合需要检测多个代谢指标的纤维化研究：先通过组学明确研究对象，再根据目标指标、检测方法的适用性及实验规模，选择合适的验证工具。

二、准备检测赖氨酸时，实验方案怎么安排？

如果计划在自己的纤维化模型中使用 KTB1470，需要提前考虑样本数量、细胞量、组织分配、结果归一化和对照设置。

1. 先计算检测总量，避免试剂不够

在上述研究中，7 个代谢物需要在多组干预实验中反复检测，包括 circ0066187 敲低与过表达、miRNA mimic 与 inhibitor、STAT3 干预以及两组回补实验，每个图的重复数为 6。

设计类似实验时，可以先按照以下关系计算：

检测总量 = 待测指标数 × 实验组数 × 每组重复数

还需要将标准曲线所占用的反应管计算进去。

以 KTB1470 为例，假设设置 4 个实验组，每组 6 个样本：

样本检测：4 × 6 = 24 管
标准曲线：7 个浓度点加空白，每个 1–2 管，共 8–16 管
一轮检测合计：32–40 管

如果需要检测多个指标，或者不同批次都要重新制作标准曲线，还应分别核算试剂用量。

2. 细胞数量要和其他检测项目一起安排

根据 KTB1470 的细胞样本提取流程，每个样本需要收集约 5×10⁶ 个细胞，并加入 1 mL Extraction Buffer 进行提取。

按照前面 24 个细胞样本计算：

24 × 5×10⁶ = 1.2×10⁸ 个细胞

这是赖氨酸检测所需的细胞总量，还没有包含 Western blot、qPCR 等其他实验项目。

对于需要转染和 TGF-β1 处理的 MRC-5 细胞，建议在铺板之前就分配好各组细胞数量，避免到取样时才发现材料不足。

如果细胞数量有限，可以先联系技术支持，确认是否能够等比例缩小提取体系。不建议在未经验证的情况下自行调整提取体积。

技术咨询：400-6800-830。

3. 小鼠肺组织需要提前分配

在 BLM 诱导的肺纤维化模型中，同一只小鼠的肺组织可能需要用于多个检测项目，包括：

Western blot 蛋白检测
qPCR 基因表达检测
HE、Masson 组织学染色
氨基酸等代谢物检测

KTB1470 的动物组织提取流程每次使用约 0.1 g 组织。

因此，取材前就应明确每个检测项目需要多少组织，以及不同肺叶分别用于什么实验。

用于组织学固定的样本不能再按新鲜组织提取流程检测代谢物。做组织学与做代谢物检测的组织，需要在取材时分开处理。

另外，BLM 诱导的肺纤维化病灶通常分布不均匀。为了提高不同样本之间的可比性，应尽量统一取样部位。这属于动物模型取样的一般实验注意事项，并非 KTB1470 特有的要求。

如果取样量不足，也可以向技术支持确认是否能够缩小提取体系。

4. 数据按什么单位报告？

细胞和组织样本的组成不同，检测结果的归一化方式也需要区分。

细胞样本可以按照细胞数量报告，例如 μmol/10⁴ 个细胞，也可以按照蛋白含量进行归一化。

组织样本则可以根据组织质量或蛋白含量报告结果。

这里有一个需要考虑的问题：随着肺纤维化发展，肺组织中的细胞和细胞外基质比例会发生变化。

因此，按组织质量归一化与按蛋白含量归一化，得到的数据需要结合各自的归一化依据解释。实验方法中应写清楚所采用的方式，并在不同实验组之间保持一致。

如果需要检测样本蛋白浓度，可配合使用亚科因 BCA 蛋白质定量试剂盒（货号 KTD3001）。

5. 不同干预组要设置对应的对照

基因干预实验涉及多种处理方式，对照组不能混用。

例如，论文中的 si-circ0066187 需要对应 NC 对照，过表达实验对应空质粒（BP）对照。

使用 miR-29b-2-5p mimic 或 inhibitor 时，也需要分别设置相应的对照。

分析不同干预条件下的赖氨酸变化时，应明确每一组数据对应哪个参照组，避免将不同对照条件下的结果直接混合比较。

三、KTB1470 测到的赖氨酸含量，该怎么理解？

KTB1470 采用茚三酮显色法。其检测原理涉及茚三酮与游离氨基发生显色反应，再根据赖氨酸标准曲线换算检测结果。

使用这种方法时，需要注意检测的特异性。

茚三酮显色体系的响应并不只来自赖氨酸，也可能受到其他含游离氨基物质的影响。

因此，试剂盒的检测结果是依据赖氨酸标准曲线换算得到的显色响应，不能直接等同于经过特异性分离鉴定的赖氨酸绝对含量。

在多组细胞或组织样本中，如果使用相同的前处理和检测条件，可以利用这一结果观察不同处理组之间的变化，但解释时仍需考虑样本基质差异及其他干扰因素。

如果研究主要关注某种干预是否伴随相关显色指标的变化，可以考虑使用这类方法进行比较。

如果需要确认变化是否特异性来自赖氨酸，或者需要获得更准确的赖氨酸绝对含量，则建议配合 LC-MS 等具有分离和特异性检测能力的方法。

在正式确定检测方案之前，也可以结合样本类型、研究目的和预期数据用途，向技术支持确认 KTB1470 是否适用。

技术咨询：400-6800-830。

四、肺纤维化研究中，赖氨酸可以搭配哪些指标？

研究肺纤维化时，单看一种氨基酸的变化，通常不足以解释整个纤维化过程。

可以根据研究目的，将检测项目分成表型指标、代谢指标和归一化指标三类。

检测类别	推荐指标	用途与注意事项
纤维化表型	α-SMA、波形蛋白、I 型胶原；HE、Masson 染色	用于观察成纤维细胞表型变化及肺组织纤维化程度
氨基酸代谢	赖氨酸（KTB1470）	用于观察不同处理条件下相应检测指标的变化，需注意显色法的特异性限制
氨基酸代谢	脯氨酸（KTB1430）	脯氨酸是胶原的重要组成氨基酸，可与赖氨酸结合观察
氨基酸代谢	谷氨酸（KTB1440）	用于检测谷氨酸；需与谷氨酰胺检测区分
结果归一化	BCA蛋白质定量（KTD3001）	按蛋白含量报告组织或细胞样本检测结果时使用

为什么可以搭配脯氨酸？

在上述研究中，肺纤维化模型里的脯氨酸升高，而赖氨酸降低。

脯氨酸本身也是胶原的重要组成氨基酸，与胶原合成及相关代谢过程有密切联系。

如果实验关注纤维化过程中氨基酸代谢的变化，可以将脯氨酸与赖氨酸一同纳入检测范围，观察两者在不同处理条件下的变化。

不过，两个指标的变化方向不同，并不能直接证明它们之间存在特定的代谢转化关系，仍需要结合其他实验结果解释。

谷氨酸和谷氨酰胺不要混淆

论文讨论了谷氨酰胺经谷氨酰胺酶作用转化为谷氨酸，以及相关代谢过程与胶原稳定性的联系。

如果准备检测这一方向，需要先明确研究对象。

亚科因 KTB1440 检测的是谷氨酸，并非谷氨酰胺。两者属于不同的代谢物，不能因为名称接近就相互替代。

正式实验前，先确认检测范围

多个代谢物同时检测时，样本用量和试剂消耗都会增加。可以先用少量样本进行预实验，查看样本的 ΔA 是否落在标准曲线对应的范围内，再确定正式实验的取样量和稀释倍数。

按照 KTB1470 所述的处理要求：

当样本 ΔA 大于 1.8 时，可用去离子水稀释样本，并在计算结果时乘以相应的稀释倍数。
当样本 ΔA 低于最低浓度标准品（0.125 μmol/mL）对应的 ΔA 时，可适当增加样本量。

具体操作和结果计算应以产品随附说明书为准。

五、总结：氨基酸检测放在实验的哪个阶段更合适？

Liu 等人的研究采用了较完整的实验路线：先用代谢组学和蛋白质组学筛选候选指标，再通过细胞、动物模型和基因干预实验验证相关变化，并进一步分析 circ0066187、miR-29b-2-5p 与 STAT3 之间的关系。

对于计划开展肺纤维化氨基酸代谢研究的实验人员，这套流程有一定参考价值。

如果已经明确需要检测赖氨酸，可以根据研究目标考虑 KTB1470。该产品支持细胞和动物组织样本的前处理，并可使用常规酶标仪完成检测，适合纳入多组样本的实验安排，但使用时需要注意茚三酮显色法的特异性限制。

正式实验前，建议先确认三件事：

检测数量： 计算指标数、实验组数、重复数和标准曲线所需的反应总量。
样本准备： 提前安排细胞数量和动物组织分配，兼顾 Western blot、qPCR 及组织学检测。
方法适用性： 通过预实验确认样本信号范围、稀释条件和归一化方式，并根据研究目标判断是否需要 LC-MS 等特异性方法补充验证。

把这些内容提前安排好，能够减少正式实验过程中因样本不足、检测范围不合适或数据解释不清而产生的问题。

参考文献

Liu B, et al. circ0066187 promotes pulmonary fibrogenesis through targeting STAT3-mediated metabolism signal pathway. Cellular and Molecular Life Sciences, 2025, 82:79.

DOI：10.1007/s00018-025-05613-z