应用指南 2026-10-28 阅读

LYS赖氨酸含量检测实验方案：动植物组织、细胞与血清样本的操作流程

使用 CheKine™ LYS赖氨酸含量检测试剂盒（微量法，货号 KTB1470）时，有几个时间要求需要提前安排好：

样本提取需要在 80℃ 水浴 20 min；
显色反应需要使用沸水浴；
稀释后的标准品须在 4 h 内用完；
显色后必须在 30 min 内完成读数。

如果样本数量较多，前处理、试剂配制和显色反应的时间很容易撞在一起。尤其是只有一台水浴锅，或者需要分批离心时，提前安排操作顺序会方便很多。

下面按实际实验流程介绍：先确认样本处理方法、结果单位和反应管数，再安排当天的操作，最后说明数据计算和常见问题的处理。

一、实验前，先确认这三件事

1. 不同样本，前处理方法不同

KTB1470 可用于动物组织、植物组织、细胞、细菌以及血清（浆）等样本。不同样本的取样量和提取步骤有所区别。

样本类型	取样要求	前处理步骤
动物组织	约 0.1 g，加入 1 mL Extraction Buffer	室温充分匀浆 → 转入 1.5 mL EP 管并盖紧 → 80℃ 水浴 20 min → 冷却后 10000 g 室温离心 10 min，取上清
植物组织	约 0.1 g，加入 1 mL Extraction Buffer	捣碎 → 室温超声 5 min（功率 20% 或 200 W，超声 3 s、间隔 7 s，重复 30 次）→ 转入 EP 管并盖紧 → 80℃ 水浴 20 min → 冷却后 10000 g 离心 10 min，取上清
细胞或细菌	5×10⁶ 个，冷 PBS 清洗，800 g 离心 2 min，弃上清	加入 1 mL Extraction Buffer → 超声 5 min（参数同上）→ 转入 EP 管并盖紧 → 80℃ 水浴 20 min → 冷却后 10000 g 离心 10 min，取上清
血清（浆）等液体	0.5 mL 样本 + 0.5 mL Extraction Buffer	盖紧 → 80℃ 水浴 20 min → 冷却后 10000 g 离心 10 min，取上清

操作时有两点需要留意。

水浴前一定要盖紧 EP 管，避免加热过程中水分散失，影响提取结果。

样本尽量使用新鲜样本。如果不能立即检测，可放在 -80℃ 保存，保存期限为 1 个月。

另外，有两类样本建议提前确认处理方案。

血清量有限的动物样本： 如果无法取得 0.5 mL 血清，可以先向技术支持确认能否等比例缩减提取体积，技术支持电话为 400-6800-830。

细胞培养上清： 其前处理方法也建议向技术支持确认。如果检测的是培养基类样本，实验设计时可以增加同批未接种细胞的培养基作为对照。这属于通用实验设计建议。

2. 先确定结果单位，避免后面缺数据

不同样本的结果计算方式不一样。建议在取样时就记录好质量、蛋白浓度或细胞数量。

结果单位	需要提前记录的数据
μmol/g	样本质量 W（g）
μmol/mg prot	上清液蛋白浓度 Cpr（mg/mL），可使用亚科因 KTD3001 BCA 试剂盒测定
μmol/mL	液体样本按 1:1 稀释，计算公式中乘 2
μmol/10⁴	细胞或细菌数量 N，以 10⁴ 为单位；例如 5×10⁶ 个对应 N = 500

尤其是组织和细胞样本，如果前期没有记录取样质量或数量，后续计算就会受到影响。

3. 提前计算需要多少反应管

该试剂盒的显色反应在 EP 管中进行，因此正式实验前需要统计反应管数量。

总管数包括：

样本管数 + 空白管数 + 标准管数

标准曲线设置 7 个浓度点，加上空白，共 8 个点。空白和各浓度标准品可以分别设置 1–2 管，因此需要 8–16 管。

例如，实验设计为 4 个处理组，每组 6 个样本：

样本管：4×6 = 24 管
空白管和标准管：8–16 管
总计：32–40 管

确定管数后，还要检查沸水浴锅的容量，以及离心机转子一次能放多少管。

如果设备容量有限，就需要分批操作，并安排好各批次的显色和读数时间。

正式检测前，建议先做一次预实验。

可以挑选 2–3 个预期差异较大的样本，观察其 ΔA 对应标准曲线的哪个区间，再决定正式实验采用的取样量或稀释倍数。

二、实验当天怎么安排？按操作顺序来

下面是一种参考安排，主要考虑了样本提取、试剂配制以及显色后读数的时间限制。具体时间可根据实验室的设备情况调整。

第一步：提前准备仪器和试剂

开始处理样本之前，先完成以下准备：

酶标仪预热 30 min 以上，检测波长设置为 570 nm。
Extraction Buffer 和 Assay Buffer 为即用型试剂，使用前平衡至室温。
检查实验所需试剂、耗材以及仪器的温度和工作状态。

提前准备好，可以减少样本提取完成后的等待时间。

第二步：进行样本提取

按照第一节对应的样本类型进行前处理。

提取步骤中需要 80℃ 水浴 20 min，随后冷却并离心 10 min。整个前处理过程通常需要 30 min 以上，具体取决于样本类型和操作情况。

水浴期间可以同步配制后续需要的试剂。

第三步：利用水浴时间配制试剂

试剂名称	配制方法	保存及注意事项
Working Substrate	向 Substrate 中加入 2 mL 95% 乙醇，充分溶解（96 T）	有刺激性，注意防护并在通风橱操作；未用完的试剂可于 4℃ 避光保存 1 周
Working Substrate Cofactor	将 Assay Buffer 全部加入 Substrate Cofactor 中，充分溶解（96 T 的 Assay Buffer 为 2 mL）	可使用 37℃ 水浴 5 min 辅助溶解；未用完的试剂可于 4℃ 避光保存 1 周
40 μmol/mL 标准品母液	向 Standard 粉末中加入 1.71 mL 去离子水，充分溶解	4℃ 避光保存 1 周；长期保存需分装后置于 -20℃ 避光，避免反复冻融

试剂复溶或混合时，尽量避免产生气泡。不同试剂之间及时更换吸头，防止交叉污染。

第四步：提取完成后，准备标准品和工作液

如果实验室只有一台水浴锅，可以先完成 80℃ 样本提取，取出样本管后将水浴锅加热至沸腾。

等待水浴锅升温时，继续完成样本离心、标准品稀释和工作液配制。

这种安排可以减少设备等待时间，属于通用实验操作经验。

① 配制标准曲线

标准品母液浓度为 40 μmol/mL，使用去离子水逐级稀释，得到 7 个浓度点。

序号	取液	去离子水	最终浓度
1	40 μL 40 μmol/mL 母液	160 μL	8 μmol/mL
2	100 μL 8 μmol/mL 标准液	100 μL	4 μmol/mL
3	100 μL 4 μmol/mL 标准液	100 μL	2 μmol/mL
4	100 μL 2 μmol/mL 标准液	100 μL	1 μmol/mL
5	100 μL 1 μmol/mL 标准液	100 μL	0.5 μmol/mL
6	100 μL 0.5 μmol/mL 标准液	100 μL	0.25 μmol/mL
7	100 μL 0.25 μmol/mL 标准液	100 μL	0.125 μmol/mL
空白	0	200 μL	0

注意：稀释后的标准品须在 4 h 内使用。

因此，建议在样本提取完成后、准备显色前再稀释标准品，避免因等待时间过长而影响使用。

② 配制检测工作液

工作液由以下两种试剂混合：

Working Substrate : Working Substrate Cofactor = 1:1

工作液需要现配现用。

每管反应需要 20 μL 工作液，即两种试剂各 10 μL。

以 40 管反应为例，考虑约 10% 的配制余量，可以按 44 管计算：

44 × 20 μL = 880 μL

因此，需要：

Working Substrate：440 μL
Working Substrate Cofactor：440 μL

将两种试剂按 1:1 混合，即可得到 880 μL 工作液。

第五步：加样并进行显色反应

在 1.5 mL EP 管中，按照下表加入相应试剂。

试剂	空白管	标准管	测定管
去离子水	10 μL	0	0
Standard	0	10 μL	0
样本	0	0	10 μL
工作液	20 μL	20 μL	20 μL

加样完成后，按以下顺序操作：

充分混匀，盖紧 EP 管管盖。
放入沸水浴中反应 5 min。
取出后用自来水冷却 10 s。
每管加入 170 μL 60% 乙醇，反复颠倒数次，使其混匀。
5000 g 室温离心 5 min。
每管吸取 150 μL，加入 96 孔酶标板。

同批反应管建议一起放入沸水浴，并尽量同时取出，记录好反应时间，减少不同管之间因加热时间不一致造成的差异。

另外，普通卡扣式 EP 管在沸水浴中可能出现崩盖的情况。实验室可以根据实际情况使用锁扣管或盖夹。这属于通用实验操作建议，并非该产品的特定要求。

第六步：570 nm 检测吸光度

将处理后的样本加入 96 孔板，在 570 nm 波长下检测吸光度。

显色后必须在 30 min 内完成读数。

建议提前规划好孔位。可以将空白和标准曲线放在前面，再依次安排样本，便于后续对应记录。

如果样本较多，需要分批显色，应分别记录各批次的显色时间和读数时间，避免超过规定的检测时间。

如果使用分光光度计进行检测，则需要根据分光光度计的要求，按比例调整检测试剂配制量。具体操作可咨询技术人员。

三、数据怎么记录和计算？

完成检测后，需要根据空白吸光度和当批标准曲线计算样本中的赖氨酸含量。

建议每批实验都记录空白、标准曲线和各样本的原始吸光度，方便后续检查数据。

1. 记录空白吸光度

批次空白：

A空白 = ＿＿＿＿

示例：A空白 = 0.062

2. 记录标准曲线数据

浓度（μmol/mL）	8	4	2	1	0.5	0.25	0.125
A标准
ΔA标 = A标准 − A空白

使用当批标准曲线记录拟合结果：

y = ＿＿ x + ＿＿

R² = ＿＿

这里需要注意，标准曲线应以标准品浓度为 y 轴、ΔA标为 x 轴。

每次实验都需要重新建立当批标准曲线。

3. 记录样本检测数据

样本编号	取样量（W / 体积 / 数量）	稀释倍数 n	A测定	ΔA测	y（μmol/mL）	结果
示例：小鼠肝	0.1 g	2	1.730	1.668	7.35	147 μmol/g

其中：

ΔA测 = A测定 − A空白

4. 按以下步骤计算结果

第一步：扣除空白值。

样本吸光度：

ΔA测 = A测定 − A空白

标准品吸光度：

ΔA标 = A标准 − A空白

第二步：代入标准曲线。

以标准品浓度为 y 轴，ΔA标为 x 轴，绘制标准曲线。

将样本的 ΔA测代入当批标准曲线方程，计算得到 y，单位为 μmol/mL。

第三步：根据样本类型换算。

结果单位	计算公式
μmol/mg prot	y ÷ Cpr × n
μmol/g	y ÷ W × n
μmol/mL	y × 2 × n
μmol/10⁴	y × n ÷ N

其中：

y：通过标准曲线计算得到的浓度；
Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；
W：样本质量（g）；
n：样本稀释倍数；
N：以 10⁴ 为单位记录的细胞或细菌数量。

计算示例：小鼠肝组织

产品提供的典型标准曲线为：

y = 4.4378x − 0.052

R² = 0.9984

该曲线仅供参考，没有自建标准曲线时才使用。

假设某小鼠肝组织样本的检测数据如下：

取样量 W = 0.1 g
稀释倍数 n = 2
A测定 = 1.730
A空白 = 0.062

先计算：

ΔA测 = 1.730 − 0.062 = 1.668

代入典型标准曲线：

y = 4.4378 × 1.668 − 0.052 ≈ 7.35 μmol/mL

再按照组织质量换算：

LYS 含量 = 7.35 ÷ 0.1 × 2

最终结果：147 μmol/g

如果不想手动计算，也可以使用官网技术中心提供的在线计算器。

四、检测结果不理想，可以从哪些地方排查？

实验过程中，有时会遇到吸光度过高、标准曲线线性不好，或者平行管差异较大的情况。

可以先根据出现的问题检查对应操作。

现象	建议处理方法
样本 ΔA 大于 1.8	使用去离子水进一步稀释样本，重新测定，计算结果时乘以稀释倍数
样本 ΔA 低于最低浓度标准品（0.125 μmol/mL）对应的 ΔA	适当加大样本量
同批标准曲线线性不好	检查稀释后的标准品是否在 4 h 内用完、移液是否准确，以及沸水浴反应时间是否一致
平行管之间差异较大	检查 10 μL 小体积加样的准确性、加样后是否混匀，以及吸取使用 95% 乙醇配制的试剂时是否润洗过枪头

标准曲线采用逐级稀释的方法，每个浓度点需要从上一浓度取 100 μL，因此移液误差有可能逐级累积。

如果标准曲线线性不好，建议重点检查稀释操作和加样过程。

平行管差异较大时，可以先查看移液操作，尤其是 10 μL 的小体积加样，以及显色过程中各管的反应时间是否一致。

需要说明的是，标准曲线线性和平行管差异的排查建议属于通用实验经验，不代表已确认的本产品特定故障原因。

五、实验需要准备哪些设备和耗材？

正式实验前，可以按照下面的清单检查。

实验阶段	设备及耗材
样本前处理	匀浆器（动物组织）、超声仪（植物组织、细胞及细菌）、80℃ 水浴锅、离心机（10000 g）、1.5 mL EP 管
试剂准备	95% 乙醇、60% 乙醇、PBS（细胞和细菌样本清洗使用）、去离子水
显色反应	沸水浴、自来水、离心机（5000 g）
吸光度检测	酶标仪（570 nm）、96 孔普通透明酶标板
其他耗材	可调节式移液枪及枪头；锁扣离心管、盖夹或固定离心管的浮漂（通用实验建议）

实验前还应确认水浴锅、离心机及酶标仪的容量，能否满足当前批次的样本数量。

如果需要分批操作，提前安排好试剂配制、显色反应和检测时间。

实验安全提醒

生化检测试剂可能具有刺激性或生物毒性。实验过程中应穿戴实验服、口罩、手套等必要的个人防护用品，并根据试剂及样本的风险要求，在通风橱或生物安全柜中完成相应操作。