LYS赖氨酸含量检测原理：茚三酮显色法测到的究竟是什么？

用茚三酮法检测赖氨酸，最后得到的是一个 570 nm 下的吸光度值。

这个数值能直接代表样本中的赖氨酸含量吗？为什么还要做标准曲线？不同样本又该怎么计算？

以 CheKine™ LYS赖氨酸含量检测试剂盒（微量法，货号 KTB1470）为例，它利用游离氨基与茚三酮发生显色反应，在 570 nm 测定吸光度，再根据赖氨酸标准曲线计算浓度。

要理解这个检测结果，得先弄清楚茚三酮的显色原理。

一、茚三酮为什么能用于赖氨酸检测？

茚三酮是实验室常用的氨基显色试剂。

含有游离氨基的物质与茚三酮加热反应后，经过氧化脱氨等过程，可以形成蓝紫色的显色产物，通常称为 Ruhemann 紫。这种物质在 570 nm 附近有特征吸收峰。

在一定浓度范围内，参与反应的游离氨基越多，颜色通常越深，吸光度也越高。实验室就是利用这种关系进行比色定量的。

赖氨酸为什么能参与这个反应？

这和赖氨酸的分子结构有关。

赖氨酸是一种含有两个氨基的氨基酸。除了常见的 α-氨基，它的侧链末端还带有一个 ε-氨基（ε-NH₂）。

KTB1470 的产品检测原理中，描述的是蛋白质中赖氨酸的游离 ε-NH₂ 与茚三酮反应，生成蓝紫色物质，再通过比色法测定含量。

不过，理解茚三酮显色法时，还要考虑它的反应特性。

茚三酮并不是只和赖氨酸反应。

其他带有游离氨基的氨基酸、肽，以及蛋白质中能够参与反应的游离氨基，同样可能产生显色信号。

例如，脯氨酸这类亚氨基酸与茚三酮反应时，主要生成黄色产物，吸收峰在 440 nm 附近，与常见氨基酸在 570 nm 附近的显色特征有所不同。

因此，从反应原理看，570 nm 下测得的吸光度反映的是样本中能够参与茚三酮显色反应的相关物质所产生的信号。

再通过赖氨酸标准品建立的标准曲线，将这一信号换算为相应浓度。

这一点在理解检测结果时尤其需要注意。

二、KTB1470 的显色反应是怎么完成的？

了解原理后，再看具体操作就容易理解了。

KTB1470 的检测过程可以分为样本提取、工作液配制、显色反应和吸光度测定几个部分。

1. 样本提取

向样本中加入 Extraction Buffer，80℃ 水浴 20 min，随后离心，取上清液作为待测液。

2. 配制工作液

分别处理两种试剂：

• Substrate：使用 95% 乙醇溶解。

• Substrate Cofactor：使用 Assay Buffer 溶解。

将配制好的两种溶液按照 1:1 的比例混合，得到工作液，现配现用。

3. 加热显色

取 10 μL 待测液，加入 20 μL 工作液，混匀后沸水浴 5 min。

这一步是显色反应的主要过程。加热后，样本中能够参与反应的相关基团与显色试剂发生反应，形成有颜色的产物。

4. 读数前处理

显色结束后，按照说明书操作：

• 自来水冷却 10 s。

• 加入 170 μL 60% 乙醇，颠倒混匀。

• 5000 g 离心 5 min。

• 取 150 μL 加入 96 孔板。

5. 测定吸光度

在 570 nm 波长下测定吸光度。

注意，显色完成后应在 30 min 内完成检测。

为什么要设置空白管和标准管？

一次完整检测中，除了样本测定管，还需要设置空白管和标准管。

空白管及各浓度标准管分别设置 1–2 管。

测得吸光度后，按下面的公式计算：

样本吸光度差值：

ΔA测 = A测定 − A空白

标准品吸光度差值：

ΔA标 = A标准 − A空白

为什么需要减去空白管？

因为试剂自身也可能存在一定的背景吸光度。扣除空白值后，可以减少试剂背景对测定结果的影响。

后续建立标准曲线和计算样本浓度，使用的都是扣除空白后的 ΔA。

三、570 nm 的吸光度，怎么换算成 μmol/g？

酶标仪给出的吸光度只是检测信号。

要知道样本中的含量，还需要将吸光度代入标准曲线，再根据样本取样量、提取体积和稀释倍数进行计算。

第一步：建立标准曲线

按照 KTB1470 的说明书，标准品加入去离子水后，配制成 40 μmol/mL 的母液。

随后逐级稀释，得到以下七个标准浓度：

8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μmol/mL。

分别测定各浓度标准品的吸光度，并扣除空白值，得到 ΔA标。

KTB1470 的标准曲线采用以下坐标设置：

• 横坐标 x：ΔA标

• 纵坐标 y：赖氨酸浓度（μmol/mL）

产品提供的典型标准曲线为：

y = 4.4378x − 0.052

R² = 0.9984

其中，x 为扣除空白后的吸光度差值，y 为根据标准曲线计算出的待测液浓度。

需要注意，产品提供的是典型标准曲线，正式实验建议每次重新制作标准曲线，使用本次实验的曲线计算结果。

第二步：根据样本类型选择计算公式

得到待测液浓度 y 后，还需要根据样本类型进行换算。

同样一个 y 值，组织样本、液体样本和细胞样本的最终计算方式并不相同。

这些公式虽然不同，但计算思路是一样的：先求出待测液的浓度，再根据样本原始取样量和稀释情况，换算成所需的报告单位。

例如，组织样本用 μmol/g 表示，液体样本用 μmol/mL 表示。需要按蛋白浓度归一化时，则使用 μmol/mg prot。

第三步：用实际数据计算一次

以产品说明书中的小鼠肝组织为例。

实验条件如下：

• 样本：0.1 g 小鼠肝组织

• 稀释倍数：2 倍（n = 2）

• 测定管吸光度：1.730

• 空白管吸光度：0.062

先计算吸光度差值：

ΔA测 = 1.730 − 0.062 = 1.668

代入典型标准曲线：

y = 4.4378 × 1.668 − 0.052

计算得到：

y ≈ 7.35 μmol/mL

再按照组织质量计算公式：

赖氨酸含量 = y ÷ W × n

= 7.35 ÷ 0.1 × 2

最终结果约为 147 μmol/g。

这样就完成了从吸光度到样本含量的换算。

如果样本吸光度超出范围怎么办？

样本检测时，ΔA 需要处于合适的测定范围内。

按照产品说明书：

ΔA 大于 1.8：

可以用去离子水对样本进一步稀释，重新测定后，在计算结果时乘以相应的稀释倍数。

ΔA 低于最低浓度标准品对应的吸光度：

当样本 ΔA 小于 0.125 μmol/mL 标准品对应的 ΔA 时，可以适当增加样本量。

正式检测前，建议先用少量样本进行预实验，确认吸光度是否处于合适的范围。

如果不方便手动计算，也可以使用 Abbkine 官网技术中心提供的在线计算器，输入相应参数进行换算。

四、测出来的赖氨酸含量，实验中应该怎么理解？

前面提到，茚三酮能够与多种含游离氨基的物质发生显色反应。

因此，使用 KTB1470 得到的结果，需要结合这一显色原理理解。

检测结果是以赖氨酸标准品为参照换算出的含量。

对于成分复杂的生物样本，其他能够参与茚三酮显色反应的物质可能对吸光度产生贡献。

这意味着，使用该方法时，要关注样本组成和检测条件对结果的影响，尤其是在解释绝对含量时。

实际实验中，可以重点注意以下几个问题。

1. 比较不同处理组时，尽量统一实验条件

例如，同一批组织样本进行处理组与对照组比较时，建议使用一致的取样、提取、显色和读数条件。

每轮实验同步设置空白管和标准曲线。

这样有助于减少不同实验批次、操作条件和显色背景对结果的影响。

2. 相对变化和绝对定量，要区分使用目的

如果实验主要关注处理组与对照组之间的变化，例如比较两组样本的检测结果是否存在差异，茚三酮显色法可以作为一种比色检测手段。

但如果研究需要准确区分不同氨基酸，或明确样本中赖氨酸的绝对含量，就需要考虑方法的特异性。

茚三酮显色体系本身不能直接区分信号来自哪一种氨基酸。

对特异性要求较高的研究，可以进一步咨询产品技术支持，或考虑使用氨基酸分析仪、HPLC 等色谱分析方法进行定量。

3. 正式实验前，先做少量预实验

建议选择 2–3 个预期存在较大差异的样本，按照检测流程进行预实验。

主要观察样本的 ΔA 是否处于标准曲线适用范围内。

如果吸光度过高，需要考虑稀释；如果吸光度过低，则可根据说明书调整样本量。

预实验可以帮助确定后续批量检测时的取样量和稀释倍数。

4. 按蛋白浓度归一化时，需要测定蛋白含量

部分细胞或组织实验需要将结果表示为 μmol/mg prot。

这时，除了赖氨酸检测，还需要测出待测上清液的蛋白浓度 Cpr。

可以搭配 Abbkine 亚科因蛋白质定量试剂盒（BCA 法，货号 KTD3001）测定蛋白含量，再将结果代入对应公式计算。

五、实验结果怎么报告更合适？

使用 KTB1470 进行赖氨酸含量检测时，建议在实验记录或研究报告中说明所采用的检测方法、样本类型、结果单位以及必要的稀释信息。

涉及不同组别比较时，应保持实验条件的一致性，并结合实际样本情况解释结果。

如果研究目标是特异性测定赖氨酸的绝对含量，则应充分考虑茚三酮显色反应的适用范围和潜在干扰。

选择检测方法时，除了关注操作是否方便，也需要确认所得数据能否满足研究目的。

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本产品仅供科学研究使用，不适用于人类或临床诊断。具体实验操作请以产品随附说明书为准。