生物素偶联试剂盒(尤其适合分子量6-20 KD样本)-LinKine™

样本制备

待标记样本的初始浓度应高于2 mg/mL，建议蛋白浓度达到2.5 mg/mL以上效果最佳，否则实验前需进行浓缩以提高浓度。待标记样本的组分（或储存缓冲液）应符合如下要求：

1. 不含有氨基成分，否则会影响偶联效果。
2. 少量BSA不会影响偶联效果，但建议使用PBS作为缓冲液。
3. 若样本中含有可能干扰标记的物质，建议用PBS置换缓冲液，具体方法为：将样本加入超滤管中，加入200-150 µL PBS，12,000 g、4℃、离心10 min，弃掉滤液；再次补齐PBS，12,000 g、4℃、离心10 min；离心后取出超滤管内芯，倒置于干净外管中，4,000 g、4℃、离心2 min，收集置换缓冲液后的样本。

待标记样本的缓冲液应满足如下要求：

实验步骤

1. 偶联物制备

不同规格建议的最适标记样本量和标记体系如下：

注意：以下操作步骤是以3×100 µg规格为例，其它规格的试剂用量请进行等比调整。如果需要调整体积，请保持样本量不变更改标记体系中Biotin labeling solution、Activated Biotin solution和去离子水的体积。为保证偶联效果，建议样本的原始浓度应大于1 mg/mL。对于其它规格，请参阅上表进行等比放大。

试剂盒组分：

1. 向待标记抗体溶液中加入15 µL Biotin labeling solution，用移液器温和混匀。
2. 吸取7.5 µL Activated Biotin solution至步骤(1)反应液中，加去离子水至150 µL，温和混匀，37℃、避光、静置1 h。

注意：步骤(1)/(2)属于标记步骤。

3. 向步骤(2)反应液中加入适量PBS（总体积500 µL），温和混匀，将溶液移至纯化柱，4℃、12,000 g、离心10 min。
4. 弃去滤液，加适量PBS（总体积500 µL）到纯化柱，4℃、12,000 g、离心10 min。
5. 取出纯化柱倒置于干净试管中，4℃、4,000 g、离心2 min，试管溶液即为偶联产物。

注意：步骤(3)/(4)/(5)属于纯化步骤。

2. 偶联物储存

偶联物避光条件下可稳定保存一个月。若需长期储存，请加入等体积甘油分装并于-20℃下避光保存，避免反复冻融。

常见问题

问1：浓缩后抗体浓度仍低于2 mg/mL？

答：如果浓缩后抗体浓度仍小于2 mg/mL，可适当调整反应体积，但最终浓度应大于1 mg/mL。步骤(1)中Biotin labeling solution应为最终反应液10%，步骤(2)中可不添加去离子水，Activated Biotin solution保持不变，您也可以根据自己实验进行适当调整。

问2：待标记样本分子量大小不同，如何选择合适的纯化柱？

答：本产品配备的超滤管适用于分子量为2-20 KD的样本。若您需要偶联的样本分子量大于20 KD，为保证偶联最佳效果，需另行配备大小合适的超滤管。

问3：待标记分子分子量小于100 KD？

答：对于分子量小于100 KD的分子，应使用相应纯化柱或分子筛柱。分子量介于50-100 KD之间，您可以使用试剂盒中的纯化柱，但是收率可能会低一些。如果分子量与50 KD相近，可在37℃下加入30 µL 0.5 µM NH4 Cl孵育10 min。

问4：对于不同分子量的样本，偶联效果是否有差异？

答：对于分子量小于5 KD的分子，偶联效果较差，您可以适当增加分子用量。

注意事项

1. 不同批次号、不同的厂家的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
2. 混合或复溶组分时，避免产生气泡。如有未使用完的试剂，请及时密封保存于4℃。
3. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
4. 保持好的实验习惯，穿戴好手套、实验服、口罩、防目镜等防护工具后再开始实验。