GFP标签蛋白免疫沉淀试剂盒(磁珠法)-IPKine™

Name: GFP标签蛋白免疫沉淀试剂盒(磁珠法)-IPKine™
Brand: Abbkine
SKU: KTI2024
Price: 1298 CNY
Availability: InStock

IPKine™ Anti-GFP Magnetic IP Kit

产品货号

KTI2024

产品特点：

高效：每毫升磁珠结合量≥0.6 mg GFP标签融合蛋白，确保高回收率。

通用：试剂盒内置非变性裂解液、TBS、洗脱缓冲液、中和缓冲液及SDS-PAGE上样缓冲液，覆盖IP全流程。

可靠：附带Mouse IgG磁珠阴性对照，可排除IgG及非特异分子干扰。

灵活：支持酸洗脱与SDS-PAGE Loading Buffer两种洗脱策略，兼容不同下游实验需求。

选择规格

20 T

¥1298

现货（当天发货）

100 T

¥4998

现货（次日发货）

🎉 限时优惠

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活动截止时间：2024年1月31日

产品概述

IPKine™ Anti-GFP Magnetic IP Kit（IPKine™ GFP标签蛋白免疫沉淀试剂盒，磁珠法）是一款专为GFP融合蛋白设计的完整免疫沉淀解决方案。通过预偶联高亲和力Anti-GFP抗体的磁珠，可在温和条件下快速捕获哺乳动物或细菌体系中的GFP标签蛋白，为下游Western blot、质谱、功能分析等提供高纯度样品。

绿色荧光蛋白（GFP）由238个氨基酸组成，分子量约26.9 kDa，在395 nm（主）与475 nm（次）激发光下发出509 nm绿色荧光。该蛋白最早从水母中分离，因其自发荧光、无物种限制、无需额外底物等优势，已成为分子与细胞生物学中最常用的报告标签之一。本试剂盒利用Anti-GFP抗体与磁珠的定向偶联，实现对GFP融合蛋白的特异性富集，有效降低非特异背景，提高IP实验成功率。

应用领域

适用于哺乳动物细胞、细菌表达体系中GFP标签蛋白的免疫沉淀（IP）、Co-IP、蛋白互作验证，以及Western blot、质谱鉴定、功能研究等下游分析。

产品参数

中文名称	GFP标签蛋白免疫沉淀试剂盒(磁珠法)-IPKine™
英文名称	IPKine™ Anti-GFP Magnetic IP Kit
产品货号	KTI2024
免疫原	合成多肽
反应性	哺乳动物#细菌
标签	GFP
检测类型	IP
偶联物	磁珠
试剂盒组分	Non-Denaturing Lysis Buffer TBS (10×) Anti-GFP Magnetic Beads Mouse IgG Magnetic Beads Elution Buffer Neutralization Buffer SDS-PAGE Loading Buffer (5×)
保存建议	按各组分标签提示分开存储，保质期12个月。
运输条件	冰袋运输（蓝冰）
警告	本文列出的产品仅供研究使用，不适用于人类或临床诊断。我们产品所推荐应用，不是建议使用我们的产品去违反任何专利或许可证。对于使用本产品可能发生的专利侵权或其他违规行为，我们不承担任何责任。

使用说明

自备耗材

磁分离架
垂直旋转混合仪
低温离心机
可调节式移液枪及枪头
去离子水
PBS缓冲液
匀浆器（组织样本）

试剂准备

Non-Denaturing Lysis Buffer：天然蛋白裂解液，用于样本的提取，即用型；置于冰上待用；IP 4℃保存。

1×TBS：临用前配制，向中添加去离子水，将稀释成；10×TBS 10×TBS 1×TBS 4℃保存。

Anti-GFP Magnetic Beads：即用型；4℃保存，避免冷冻。

Mouse IgG Magnetic Beads：即用型；4℃保存，避免冷冻。

Elution Buffer：即用型；用于非变性的酸洗脱，4℃保存。

Neutralization Buffer：即用型；用于中和酸洗脱的非变性蛋白，4℃保存。

SDS-PAGE Loading Buffer (5 )× ：即用型，-20℃保存。

注意：（1）蛋白酶抑制剂不是必须加入，可根据实验需求在 Non-Denaturing Lysis Buffer中分别添加选择不同类型的蛋白酶抑制剂；（2）建议使用低吸附的离心管进行磁珠操作，可减少磁珠粘附离心管壁。在中添加的非离子型表面活性剂（如 Triton X-100 Tween-20 NP-40、或）也可以有效降低耗材对磁珠的粘附。1×TBS 0.01%-0.1%(V/V)

实验步骤

A. 蛋白样品的准备

注意：取一定量的制备好的样本作为全细胞裂解液（）用于后续的检测。WCL Western Blotting

1. 细胞蛋白提取：

(1) 10 cm 80%-90% PBS 1细胞收集（贴壁细胞：细胞培养皿中单层细胞长满，吸除细胞培养液，洗涤次；悬浮细胞：离心收集 5×10 6 个细胞，洗涤次）。PBS 1
(2) 0.5-1 mL Non-Denaturing Lysis Buffer加预冷的到细胞中，4℃ 裂解细胞，期间用移液枪反复吹打，然后将细胞悬浮液转移5 min到新的离心管中。
(3) 12,000 rpm 4， ℃ ，离心，收集上清。10 min

2. 组织蛋白提取：

(1) 0.1 g称取组织，加入 1 mL Non-Denaturing Lysis Buffer，匀浆器研磨。（若需要提高蛋白浓度，可以适量减少 Non-Denaturing Lysis Buffer用量）。
(2) 5 min将匀浆液转移至新的离心管中，冰上裂解。
(3) 12,000 rpm 4， ℃ ，离心，收集上清。10 min

3. 细菌蛋白提取：

(1) 12,000 rpm 4， ℃ ，离心收集细菌，洗涤次。2 min PBS 1
(2) 1 mL 100-200 μL Non-Denaturing Lysis Buffer每菌液加重悬细菌，冰浴超声波破碎细菌 5 min（功率或，超声，20% 200 W 3 s间隔，重复次）。7 s 30
(3) 12,000 rpm 4， ℃ ，离心，收集上清。10 min

注意：（1）样品中必须带有 GFP-Tag的目的蛋白及其复合物；（2）免疫沉淀宜用新鲜的蛋白样品为佳；（3）免疫沉淀实验中不同类型的抗原与抗体间的亲和力是有区别的，抗体与抗原结合还会受到裂解液和缓冲液的影响，如使用 Non-Denaturing Lysis Buffer不能获得最佳的实验结果，可自行优化操作细节或者筛选及配制合适裂解液和缓冲液进行实验。

B. 磁珠准备

注意：按照每蛋白样品取的的比例吸取磁珠混悬液。以下实验步骤按照加入的500 μL 20 μL Anti-GFP Magnetic Beads 20 μL Anti-GFP Magnetic Beads的量，进行具体操作说明。

(1) 1.5 mL 10 s将磁珠加入离心管中，离心管置于磁分离架上，静置，吸弃上清。
(2) 1 mL 1 TBS Anti-GFP Magnetic Beads 10 s 3 20 μL 1加入 × ，重悬，离心管置于磁分离架上，静置，吸弃上清，重复次，用 × TBS重悬磁珠。

C. 免疫沉淀

(1) Anti-GFP Magnetic Beads 500 μL 1-2 h 4处理好的加入蛋白样品，置于垂直旋转混合仪室温下孵育或 ℃过夜。

注意：a）建议酌情在部分样品中加入进行免疫沉淀以作为阴性对照，可排除本身和目的蛋白或其它特定生物分子的非特异性结合；b）对于使用进行免疫沉淀后续发现背景非常高的情况，可以考虑预处理样品，以消除非特异性吸附，然后再使用进行免疫沉淀。Mouse IgG Magnetic Beads IgG Anti-GFP Magnetic Beads Mouse IgG Magnetic Beads Anti-GFP Magnetic Beads

(2) 10 s离心管置于磁分离架上，静置，去除上清。上清液可转移至新的离心管中，用于检测免疫沉淀的效果。
(3) 1 mL 1×TBS Anti-GFPMagnetic Beads加入，重悬，离心管置于磁分离架上，静置，吸弃上清，重复次，直至上清液10 s 3-5 OD280 0.05小于。
(4) 洗脱

a) SDS-PAGE Western Blotting 100 μL 5）此方法洗脱的样品适用于变性洗脱法：和检测。向离心管中加入（倍磁珠体积）1×SDS-PAGE Loading Buffer 1 TBS SDS-PAGE Loading Buffer (5 ) 5 100（用 × 将 × 稀释倍）混匀， ℃ 加热，然后进行离心，5 min 800 rpm 1 min SDS-PAGE Western Blotting离心，收集上清液，进行和检测分析。
b) 酸洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向离心管中加入 100 μL（倍磁珠体积）5 Elution Buffer混匀，然后在室温下置于垂直旋转混合仪孵育，，5-10 min 800 rpm 4℃ ，离心，吸取上清液，收集洗脱组分，即为标2 min GFP签蛋白及其复合物，收集上清液至新的离心管中，并立即加入，将洗脱组分调节至，为了获10 μL Neutralization Buffer pH 7.0-8.0得最大的洗脱效率，可重复用酸洗脱，并将相同样品合并，标签蛋白及其复合物置于GFP 4℃待用，-20℃或-80℃长期保存。可向磁珠沉淀中加入 100 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer，用于检测免疫沉淀及洗脱效果。

注意：a）对于少数样品，由于目的蛋白的差异，GFP-Tag GFP与抗体的结合力非常强，酸洗脱的效果可能比较差，建议优先使用 SDS-PAGE Loading Buffer变性洗脱法；b）由于目的蛋白的差异，酸性洗脱法的洗脱效率也会存在一定的差异。如果对洗脱效率的要求比较高，可对酸性洗脱液的值在之间进行适当的调整，相应的中和液的值或量也要进行适当的调整，例如pH 2.5-3.1 pH 100 μL 0.1 M Glycine-HCl, pH2.8 15 μL 1 M Tris-HCl, pH 8.5酸洗脱液（）和中和液（）。

结果展示

图标签蛋白免疫沉淀试剂盒磁珠法用于. GFP ( ) GFP-Tag融合蛋白的免疫沉淀效果图，图中数据仅供参考。

HEK293T GFP-Tag 48 h细胞转染质粒后，Non-Denaturing Lysis Buffer裂解细胞，免疫沉淀检测，Western Blotting GFP一抗选用标签小鼠单克隆抗体（）（货号：），稀释比例；二抗选用山羊抗小鼠重链二抗，标记（消除轻链3D3 ABT2020 1:5000 IgG HRP干扰）（货号：A25112 1:2000 ECL BMU102 Lane 1），稀释比例；使用超敏型发光液（飞克级）（货号：）显影。为全细胞裂解液；为免疫沉淀后经变性洗脱后的样品；为免(WCL) Lane 2 Mouse IgG Magnetic Beads Lane 3 Anti-GFP Magnetic Beads疫沉淀后经变性洗脱后的样品；为免疫沉淀后经酸洗脱后的样品。酸洗脱仅含有Lane 4 Anti-GFP Magnetic Beads GFP-Tag融合蛋白，不包含抗体重链和轻链。

常见问题

问题	原因	建议解决方案
目的蛋白洗脱量极低	蛋白未完全洗脱	更换洗脱方式
目的蛋白无表达	蛋白表达量低	1. 加大样品量 2. 优化表达条件，提高蛋白表达量
洗涤剧烈	-	减少洗涤时间或次数
孵育时间不足	-	延长孵育时间
样品中有干扰物质	-	避免裂解产物中含有可破坏抗体功能的物质，如高浓度、DTT 2-巯基乙醇或其他还原剂
检测系统问题	-	如果使用检测： 1. 用适当的对照品验证一抗、二抗的结合能力及反应性 2. Marker使用预染蛋白或丽春红染色确保转膜充分 3. 使用新鲜的底物或者尝试不同的检测系统WB
洗脱液中多个蛋白条带	蛋白质与抗体非特异性结合，离心管问题导致洗涤问题	1. IgG小鼠磁珠预处理裂解产物，去除非特异性吸附 2. 磁珠进行最后的洗涤后，将整个样品转移到一个干净的离心管中，再分离
洗涤不充分	-	1. 增加洗涤次数 2. 15 min延长洗涤的时间，每次洗涤至少要孵育 3. 选择其他清洗缓冲液，在清洗液中加入盐或者非离子型去垢剂 4. 低速离心以避免变性蛋白的非特异性捕获
目的蛋白在室温条件不稳定	-	低温条件下进行实验，例如 4℃
实验过程中蛋白酶活性引起的蛋白质降解	-	裂解液中添加蛋白酶抑制剂