线粒体呼吸链复合体Ⅱ活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 605 nm处的吸光度）
• 恒温箱、制冰机、低温离心机
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• 匀浆器或研钵

试剂盒组分

试剂准备

• ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
• Working Reagent IV：临用前配制；每瓶 Reagent IV 加入 0.5 mL Reagent V，25 μL Reagent VII 和 25 mL Reagent VIII，充分溶解待用，现用现配。Working Reagent IV 有少许沉淀属正常现象，如对结果有影响，请过滤。Working Reagent IV 易失效，故多提供一瓶，如需更多量，请与 Abbkine 技术支持联系。
• Reagent V：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。
• Reagent VI：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
• Reagent VII：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
• Reagent VIII：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

注意：Reagent V有毒且有刺激性气味，Reagent VIII 有毒，建议在通风橱进行实验。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，以保证酶的活力。

线粒体呼吸链复合体Ⅱ的提取：

1. 准确称取 0.1 g组织或收集 500万个细胞，加入 1 mL ReagentⅠ和 10 µL Reagent III，用匀浆器或研钵冰浴匀浆。
2. 离心匀浆液，600 g，5 min，4℃，收集上清液至另一新的离心管中，舍弃沉淀。
3. 再次离心上清，11,000 g，10 min，4℃，沉淀即为提取的线粒体，用作第 5步操作。
4. （选做）上清液即为胞浆提取物，可作为样本用于测定从线粒体泄漏的线粒体呼吸链复合体Ⅱ（此步可选做，可用于判断线粒体提取效果）。
5. 在沉淀中加入 200 µL Reagent II 和 2 µL Reagent III，充分重悬沉淀，用于下一步线粒体呼吸链复合体Ⅱ酶活性检测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长至 605 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2. 在 96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入 10 µL样本、25 µL ReagentⅥ和 200 µL Working Reagent IV，轻敲板，充分混匀后，立即读取 605 nm处 0 min的初始吸光值 A1和 2 min后的吸光值 A2，计算ΔA=A1-A2。

注意：1. 为保证实验结果的准确性，需先取 1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（大于 1.5）或ΔA大于 0.4，可用 Reagent II 稀释样本后再测定，计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高检测数值，若ΔA出现负值，则说明样本中不含复合体Ⅱ或已降解。2. 线粒体呼吸链试剂盒是酶动力学原理的试剂盒，反应比较快，且反应趋于平衡之后，该可逆反应可能会出现负反应，建议如下：（1）样本组数：2-3个左右，该酶促反应速度快，且为酶促反应，需要把握好起始时间点和反应后的时间点；（2）仪器提前预热，且加样可安排在酶标仪旁边进行，加样混匀后直接放入；（3）如果ΔA偏小，可增加样本量（组织克重或者细胞数量），或者减少提取液用量；（4）样本尽量新鲜提取，如果不能马上使用，则把完整细胞或者分装的组织保存在-80℃，一个月内使用；（5）Working Reagent IV临用前配制。3. 该试剂盒提取的样本也可以适用于KTB1850、KTB1870、KTB1880、KTB1890的测定。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96孔板测定的计算公式

1. 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g组织在反应体系中每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

上清中复合体Ⅱ活力的计算：

复合体Ⅱ上清活力(U/g 鲜重)=1,130×ΔA 上清÷W

沉淀中复合体Ⅱ活力的计算:

复合体Ⅱ沉淀活力(U/g 鲜重)=226×ΔA 沉淀÷W

样本复合体Ⅱ总活力的计算：

复合体Ⅱ总活力(U/g 鲜重)=1,130×ΔA 上清÷W+226×ΔA 沉淀÷W

2. 按细胞密度计算

单位的定义：每 1万个细胞每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅱ活力(U/104 cells)=0.452×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2.35×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，21×10³ mol/L/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；10⁹：单位换算系数，1 mol=10⁹nmol；V 样：加入样本体积，0.01 mL；T：反应时间，2 min；ΔA 上清：上清测定值；W：样本重量，g；V 提取：提取体系体积，1.01 mL；ΔA 沉淀：沉淀测定值；V 重悬：重悬沉淀体积，0.202 mL；500：细胞总数，500万。

B. 使用微量玻璃比色皿进行测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。