线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

*请在实验前检查各组分的量。

*各组分在规格基础上额外提供 10%的量用于进行标准曲线制作或预实验。

03 自备仪器与试剂

04 注意事项

• 正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。
• 本试剂盒兼容分光光度计检测，请按照分光光度计检测要求按比例调节检测试剂配制量。如有疑问，可咨询本司技术人员（400-6800-830）。
• 生化检测试剂普遍具有刺激性、生物毒性等，为了您的安全和健康，请在实验全程做好生物安全防护，穿戴实验服、口罩、手套、头套等安全护具，在通风橱、生物安全柜中进行实验。
• 本产品仅供科学研究使用，不适用于临床诊断。

05 实验流程

05-1 试剂准备

05-2 样本制备

注意：推荐使用新鲜样本。样本尽量新鲜提取，如果不能马上使用，则把完整细胞或者分装的组织保存在-80℃，一个月内使用。该试剂盒提取的样本也可以适用于 KTB1850、KTB1860、KTB1870、KTB1890试剂盒。

• 动植物组织或细胞样本：
  1. 称取约 0.1 g 组织样本或收集 5×10⁶个细胞，加入 1 mL Reagent Ⅰ和 10 μL Reagent Ⅲ，用匀浆器或研钵冰浴匀浆。
  2. 离心匀浆液，600 g，5 min，4℃，收集上清液至另一新的离心管中，舍弃沉淀。
  3. 再次离心上清，11000 g，10 min，4℃，沉淀即为提取的线粒体，用作第 5步操作。
  4. 上清液即为胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的线粒体呼吸链复合体Ⅳ（此步可选做，可用于判断线粒体提取效果）。
  5. 在沉淀中加入 200 µL Reagent Ⅱ和 2 µL Reagent Ⅲ，充分重悬沉淀，置于冰上待测。

05-3 实验步骤

1. 酶标仪准备：预热 30 min以上，调节波长到 550 nm。
2. 96孔板中依次加入 200 μL工作液和 10 μL样本，迅速混匀。
3. 吸光度检测：反应体系混匀后立即读取 550 nm处 0 min时的吸光值 A1和 1 min时的吸光值 A2。

06 结果计算

06-1 自动计算

为帮助您更轻松、准确地完成相关计算，我们特在官网提供了"在线计算器小工具"。您无需手动计算，只需在网页上输入数值，即可快速获得可靠结果。访问方式：请扫描右侧二维码或访问官网[https://www.abbkine.cn]进入"技术中心"查找"在线计算器"工具。

06-2 手动计算

以下为您提供的推导过程计算公式和简洁计算公式，两者完全相等。

1. 数据处理

计算ΔA=A1-A2，ΔA 上清=A1 上清-A2 上清，ΔA 沉淀=A1 沉淀-A2 沉淀。

2. 样本线粒体呼吸链复合体Ⅳ活力计算

按样本质量计算

单位的定义：每 g组织在反应体系中每分钟催化降解 1 nmol还原型细胞色素 C定义为一个酶活力单位。

按细胞数量计算:

单位的定义：每 10⁴个细胞每分钟催化降解 1 nmol还原型细胞色素 C定义为一个酶活力单位。

V 反总：反应体系总体积，2.1×10^-4 L；ε：细胞色素 C摩尔消光系数，19.1×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5 cm；10⁹：单位换算系数，1 mol=10⁹ nmol；V 样：加入样本体积，0.01 mL；T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；V 提取：提取体系体积，1.01 mL；V 重悬：重悬沉淀体积，0.202 mL；500：细胞数量，5×10⁶，以 10⁴为单位。