线粒体呼吸链复合体Ⅲ活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 550 nm处的吸光度）
• 恒温箱、制冰机、低温离心机
• 非聚苯乙烯材质的 96孔石英/玻璃板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• 匀浆器或研钵

试剂盒组分

试剂准备

• ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
• Reagent VI：即用型；使用前，平衡到室温；分装后-20℃避光保存 6个月，避免反复冻融。

工作液的配制：临用前，将 Reagent V 转移到 Reagent IV 中混合溶解，用不完的试剂-20℃避光分装保存 2周，避免反复冻融。如果检测样本是哺乳动物来源，请置于 37℃孵育 5 min；如果样本是其他物种，则置于 25℃孵育 5 min。

样本制备

线粒体呼吸链复合体Ⅲ的提取：

1. 准确称取 0.1 g组织或收集 500万个细胞，加入 1 mL ReagentⅠ和 10 µL Reagent III，用匀浆器或研钵冰浴匀浆；
2. 离心匀浆液，600 g, 5 min, 4℃，收集上清液至另一新的离心管中，舍弃沉淀；
3. 再次离心上清，11,000 g, 10 min, 4℃，沉淀即为提取的线粒体，用作第 5步操作；
4. (选做)上清液即为胞浆提取物，可作为样本用于测定从线粒体泄漏的线粒体呼吸链复合体Ⅲ，用于判断线粒体提取效果；
5. 在沉淀中加入 200 µL Reagen II 和 2 µL Reagent III，充分重悬沉淀，用于下一步线粒体呼吸链复合体Ⅲ酶活性检测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长至 550 nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 在 96孔石英/玻璃板（非聚苯乙烯材质）或微量玻璃比色皿中加入 25 µL Reagent Ⅵ和 200 µL工作液，充分混匀后，准确反应 2 min，然后加入 10 µL样本充分混匀后，立即读取 550 nm处 0 min的初始吸光值 A1和 2 min后的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。

结果计算

A. 使用 96孔石英/玻璃板（非聚苯乙烯材质）测定的计算公式

1. 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g组织在反应体系中每分钟生成 1 nmol还原型细胞色素 C定义为一个酶活力单位。

上清中复合体Ⅲ活力的计算：

复合体Ⅲ上清活力(U/g鲜重)=1,243×ΔA 上清÷W

沉淀中复合体Ⅲ活力的计算:

复合体Ⅲ沉淀活力(U/g鲜重)=249×ΔA 沉淀÷W

样本复合体Ⅲ总活力的计算：

样本复合体Ⅲ总活力即为上清中复合体Ⅲ活力与沉淀中复合体Ⅲ活力之和。

按样本质量计算：复合体Ⅲ总活力(U/g鲜重)=1,243×ΔA 上清÷W+249×ΔA 沉淀÷W

2. 按细胞密度计算

单位的定义：每 1万个细胞每分钟生成 1 nmol还原型细胞色素 C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅲ活力(U/104 cells)=0.497×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2.35×10^-4 L；ε：还原型细胞色素 C摩尔消光系数，19.1×10³ mol/L/cm；d：96孔石英/玻璃板（非聚苯乙烯材质）光径，0.5 cm；10⁹：单位换算系数，1 mol=10⁹ nmol；V 样：加入样本体积，0.01 mL；T：反应时间，2 min；ΔA 上清：上清测定值；W：样本重量，g；V 提取：提取体系体积，1.01 mL；ΔA 沉淀：沉淀测定值；V 重悬：重悬沉淀体积，0.202 mL；500：细胞总数, 500万。

B. 使用微量玻璃比色皿进行测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。