线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

试剂盒组分

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 660 nm处的吸光度）
• 恒温箱、制冰机、低温离心机
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• 匀浆器或研钵

试剂准备

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Reagent Ⅱ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Reagent Ⅲ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Reagent Ⅳ：临用前配制，48 T加入 1 mL去离子水充分溶解，96 T加入 2 mL去离子水充分溶解。未用完的试剂需分装后-20℃避光保存 1个月，避免反复冻融。

Reagent Ⅴ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Reagent Ⅵ：临用前配制，48 T加入 2.4 mL去离子水充分溶解，96 T加入 4.8 mL去离子水充分溶解后使用。未用完的试剂需分装后-20℃避光保存 1个月，避免反复冻融。

Reagent Ⅶ：临用前配制，48 T加入 7 mL去离子水充分溶解，96 T加入 14 mL去离子水充分溶解后使用。未用完的试剂需分装后-20℃避光保存 1个月，避免反复冻融。

Reagent Ⅷ：临用前配制，48 T加入 7 mL去离子水充分溶解，96 T加入 14 mL去离子水充分溶解后使用。未用完的试剂需分装后-20℃避光保存 1个月，避免反复冻融。

Reagent Ⅸ：即用型；室温保存。

定磷试剂的配制：配制比例按照去离子水 : Reagent Ⅶ : Reagent Ⅷ : Reagent Ⅸ=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，现用现配）。

注意：配试剂最好用新的玻璃器皿或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

标准曲线设置

按下表所示用去离子水将 10 mM标准品稀释为 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156 mM的标准溶液。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，以保证酶的活力。

线粒体呼吸链复合体Ⅴ的提取：

1. 准确称取 0.1 g组织或收集 500万个细胞，加入 1 mL ReagentⅠ和 10 µL Reagent Ⅲ，用匀浆器或研钵冰浴匀浆；
2. 离心匀浆液，600 g，5 min，4℃，收集上清液至另一新的离心管中，舍弃沉淀；
3. 再次离心上清，11,000 g，10 min，4℃，沉淀即为提取的线粒体，用作第 5步操作；
4. (选做)上清液即为胞浆提取物，可作为样本用于测定从线粒体泄漏的线粒体呼吸链复合体Ⅴ（此步可选做，可用于判断线粒体提取效果）；
5. 在沉淀中加入 800 µL Reagent Ⅱ和 8 µL Reagent Ⅲ，充分重悬沉淀，用于下一步线粒体呼吸链复合体Ⅴ酶活性检测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 660 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2. 酶促反应（在 EP管中依次加入下列试剂）：

混匀后盖紧，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确孵育 30 min

3. 混匀后，室温（25℃左右），4,000 g，离心 10 min，取上清液。
4. 定磷(在 96孔板或微量玻璃比色皿中加入下列试剂）

5. 混匀，室温静置 10 min后，测定 660 nm吸光值。计算ΔA 测=A 测定-A 对照，ΔA 标=A 标准-A 空白。（空白管只需做 1管）

注意：1. 为保证实验结果的准确性，需先取 1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于 1.5）可用 Reagent Ⅱ稀释样本后再测定，计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA 测偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高检测数值，若ΔA 测出现负值，则说明样本中不含复合体Ⅴ或已降解。2. Reagent Ⅲ具有一定的毒性，Reagent Ⅸ具有腐蚀性，请操作时做好防护措施。3. 该试剂盒提取的样本也可以适用于 KTB1850、KTB1860、KTB1870、KTB1880的测定。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制：以标准液浓度为 y轴，ΔA 标为 x轴，绘制标准曲线（浓度为 y轴更方便计算结果）。
2. 无机磷(Pi)含量的计算：将∆A 测带入方程得到 y值(mM)。
3. 线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性计算

(1) 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g组织在反应体系中每分钟产生 1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位。

上清中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性的计算：

上清中复合体Ⅴ活性(U/g鲜重)=(y 上清×V 酶促×10⁶)÷(V 样÷V 提取×W)÷T=80.8×y 上清÷W

沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性的计算：

沉淀中复合体Ⅴ活性(U/g鲜重)=(y 沉淀×V 酶促×10⁶)÷(V 样÷V 重悬×W)÷T=64.64×y 沉淀÷W

样本线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性的计算：

样本线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性即为上清中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性与沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性之和。

按样本质量计算：

线粒体呼吸链复合体Ⅴ总活性(U/g鲜重) =80.8×y 上清÷W+64.64×y 沉淀÷W

(2) 按细胞密度计算

单位的定义：每 1万个细胞每分钟产生 1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位

线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性(U/10⁴ cells)=(y×V 酶促×10⁶)÷(V 样÷V 重悬×500)÷T=0.129×y

V 酶促：酶促反应体系总体积，1.2×10^-4 L；10⁶：单位换算系数，1 mmol=10⁶ nmol；V 样：加入样本体积，0.05 mL；T：反应时间，30 min；V 提取：提取体系体积，1.01 mL；W：样本重量，g；V 重悬：重悬沉淀体积，0.808 mL；500：细胞总数，500万。