脯氨酸含量测定实验全流程方案：样本处理、显色反应到结果计算一次说清
网上能找到的脯氨酸检测方法大多是把原理说一遍，操作步骤写得很简略，实际做的时候到处是坑。这篇文章把完整流程从头捋一遍，包括一些说明书不会写但真正影响结果的细节。
用的是茚三酮比色法，也就是目前科研实验室里用得最多的那种，检测波长520 nm，适用于植物组织、动物组织、细胞、细菌、血清（浆）等常见样本类型。
实验前需要准备什么
仪器方面，必须要有的是能测520 nm的酶标仪，以及能加热到100℃的恒温水浴振荡器。水浴振荡器这个很关键，不是普通水浴锅，是要能在沸水浴状态下同时振荡的那种，后面提取步骤需要用到。
如果做组织样本，还需要匀浆器。细胞或者细菌样本的话，需要超声波破碎仪。
耗材上，96孔普通透明酶标板，可调移液枪和枪头。样本量多的话准备多通道移液器，能省不少时间。另外要备一些有盖的EP管，沸水浴步骤必须用有盖的，防止水分散失。
脯氨酸含量检测试剂盒里通常包含Extraction Buffer、Assay Buffer、Chromogen显色剂、PRO标准品粉末。需要自备的是PBS（pH 7.4）、甲苯、去离子水。甲苯有毒，提前确认通风橱能用。
样本制备
这一步是整个实验成败的基础，不同样本类型差异很大，不能混用同一套操作。
植物和动物组织
称取约0.1 g组织，加1 mL Extraction Buffer，冰浴条件下匀浆。匀浆完之后放到沸水浴振荡器里提取10分钟，然后10000 g常温离心10分钟，取上清。上清冷却到室温再用。
称样的时候尽量精确，0.1 g这个量后面计算要用到，差个10 mg结果就不一样。冰浴匀浆是为了减少蛋白降解，但也不用过于紧张，快速操作就行。
细胞样本
收集足够数量的细胞（通常5×10⁶起），800 g离心2分钟，弃上清，加1 mL Extraction Buffer重悬。然后冰浴超声破碎：功率20%（或200 W），超声3秒、间隔7秒，重复30次。破碎完再放沸水浴提取10分钟，10000 g离心10分钟，取上清冷却待用。
超声这步很多人出问题。间隔时间要够，连续超声会导致样本升温，影响活性物质。另外超声头要插到液面以下，别刚刚碰到液面，那样效率很差。
细菌样本
操作和细胞基本一样，但细菌细胞壁更厚，破壁的要求更高。超声条件可以参考细胞的，如果破壁不理想可以适当增加循环次数。做之前可以先用显微镜看一下破碎效果，确认大部分细菌已经裂解再进行后续步骤。
血清（浆）
取0.1 mL血清，加0.9 mL Extraction Buffer，充分混匀。放沸水浴振荡提取10分钟，10000 g离心10分钟，取上清冷却。血清样本相对简单，没有破碎步骤，但沸水浴这步一样不能省。
标准品配制
这步要在正式实验当天做，配好的稀释液4小时内要用完，不能提前备好放着。
先配母液：称取1 mg PRO标准品粉末，加0.1 mL去离子水充分溶解，得到10 mg/mL的储存液。
再从储存液稀释到100 µg/mL的工作液：取10 µL 10 mg/mL储存液，加990 µL去离子水，混匀。
然后从100 µg/mL工作液做梯度稀释，配一组标准曲线浓度点：
| 编号 | 100 µg/mL工作液（µL） | 去离子水（µL） | 终浓度（µg/mL） |
|---|---|---|---|
| S1 | 160 | 40 | 80 |
| S2 | 80 | 120 | 40 |
| S3 | 40 | 160 | 20 |
| S4 | 20 | 180 | 10 |
| S5 | 8 | 192 | 4 |
| S6 | 4 | 196 | 2 |
| S7 | 2 | 198 | 1 |
| S8 | 1 | 199 | 0.5 |
| 空白 | 0 | 200 | 0 |
每个浓度点换一个新吸头，不能偷懒。稀释误差是标准曲线线性差的最常见原因，很多时候不是试剂有问题，是操作时吸头没换导致交叉污染。
检测体系配制
在有盖EP管里按以下体积加样，不要在酶标板上直接操作这步，因为后面要沸水浴，酶标板放不进去。
| 标准管 | 空白管 | 样本管 | |
|---|---|---|---|
| 样本上清 | — | — | 100 µL |
| 对应浓度标准液 | 100 µL | — | — |
| 去离子水 | — | 100 µL | — |
| Assay Buffer | 100 µL | 100 µL | 100 µL |
| Chromogen | 100 µL | 100 µL | 100 µL |
按顺序加完之后，盖紧EP管盖，混匀，放入沸水浴振荡30分钟。期间每10分钟振荡一次。
盖紧这件事要认真对待。30分钟沸水浴，如果盖子没盖好，水分会蒸发，体系浓缩，吸光度偏高，但偏高多少每次不一样，这种误差根本没法校正。
30分钟到了取出来，冷却到室温。这时候每管再加200 µL甲苯，操作必须在通风橱里进行。
甲苯萃取和测定
加完甲苯之后，振荡30秒，然后静置。等两相分层清楚了，吸取上层甲苯相100 µL转移到96孔酶标板里，在520 nm测吸光度。
静置时间因样本而异。一般样本1到3分钟就能分层，脂质含量高的动物组织可能需要更久。不要着急，分层不彻底就吸，容易带入下层水相，吸光度会偏低而且不稳定。
吸管尖插入上层液体的时候动作要慢，不要插太深。两相交界处附近尽量不要动，就取中间那部分甲苯层就够了。
测完吸光度分别记为A标准、A空白和A测定。
结果计算
第一步，算各管的ΔA：
- ΔA标准 = A标准 - A空白
- ΔA测定 = A测定 - A空白
第二步，以标准品浓度（µg/mL）为Y轴、ΔA标准为X轴绘制标准曲线，做线性拟合，得到方程 y = kx + b。把ΔA测定代入，算出对应的 y 值（单位 µg/mL）。
第三步，根据实验需要选对应公式换算：
按样本鲜重：
PRO（µg/g 鲜重）= 3 × y ÷ W × n
按细胞或细菌数量：
PRO（µg/10⁴）= 3 × y ÷ N × n
按液体体积：
PRO（µg/mL）= 3 × y × n
按蛋白浓度：
PRO（µg/mg prot）= 3 × y ÷ Cpr × n
其中 W 是样本鲜重（g），N 是细胞/细菌数量（以10⁴为单位），Cpr 是样本蛋白浓度（mg/mL），n 是样本稀释倍数。系数3来自反应体系总体积（300 µL）和样本加入量（100 µL）之比乘以提取体系体积（1 mL）的换算，不需要自己推，按公式套就行。
如果做了稀释，n值不是1，这个别忘了乘进去。
几个会影响结果但说明书不一定写的细节
Chromogen和标准品都是光敏的。 显色剂从冰箱取出来之后要避光放置，操作过程也尽量别让它长时间暴露在强光下。标准品粉末和配好的溶液也一样。这些细节不注意，做出来的颜色会偏淡，曲线斜率偏低。
试剂用前要平衡到室温。 Extraction Buffer和Assay Buffer从4℃取出来直接用问题不大，但Chromogen如果太冷，显色反应会偏慢，建议提前20到30分钟从冰箱拿出来放室温。
样本如果不能当天做，放-80℃，不要放-20℃。 -20℃下脯氨酸会有一定程度的降解，-80℃更稳定，可以保存约1个月。但最好还是用新鲜样本，特别是做精确定量的实验。
正式实验前先做预实验。 找2到3个预期差异比较大的样本先跑一遍，确认ΔA值落在标准曲线范围内。如果处理组样本ΔA已经接近1.5，说明浓度偏高，正式实验需要提前稀释；如果ΔA低于0.05，说明信号太弱，可能要增加上清加入量或者检查提取步骤。
结果出来之后怎么呈现
做完脯氨酸检测的数据，一般有两种呈现方式：单独列出各组PRO含量并做统计检验，或者和其他生理指标（SOD、MDA、可溶性糖等）一起综合分析抗逆表型。
植物逆境研究里后者更常见，PRO单独的数字意义不大，放在整体生理响应的背景下才有说服力。如果是抗逆育种相关的研究，建议在方法部分写清楚提取体系和计算方式，审稿人有时候会问，前处理写得越具体越好。
肿瘤代谢方向用到PRO定量的研究，近年来主要集中在P5CS相关通路，检测的是细胞内PRO水平的相对变化，更强调组间重复性，建议每个实验条件做至少3个生物学重复，标准曲线也要每次跟着做。
方法参考：CheKine™ 脯氨酸（PRO）含量检测试剂盒（微量法）说明书，货号 KTB1430 | 技术咨询：400-6800-830
