通用型免疫(共)沉淀(IP/Co-IP)工具箱(磁珠)

自备耗材

• 磁分离架
• 垂直旋转混合仪
• 低温离心机
• 可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• PBS缓冲液
• 匀浆器（组织样本）
• SDS-PAGE Loading Buffer

试剂准备

Non-Denaturing Lysis Buffer：天然蛋白裂解液，用于IP样本的提取，即用型；置于冰上待用；4℃保存。

Denaturing Lysis Buffer：变性蛋白裂解液，可用于直接WB检测样本的提取，即用型；置于冰上待用；4℃保存。

1×Wash Buffer：临用前配制，向10×Wash Buffer中添加去离子水，将10×母液稀释成1×工作液；4℃保存。

注意：10×Wash Buffer 4℃37℃保存会产生沉淀，使用前可在℃水浴中预热10 min溶解沉淀。

Protein A/G Magnetic Beads：即用型；4℃保存，避免冷冻。

Elution Buffer：即用型；用于非变性蛋白洗脱，4℃保存。

Neutralization Buffer：即用型；用于中和洗脱的非变性蛋白，4℃保存。

100×Proteinase Inhibitor Cocktail：临用前Lysis Buffer中加入终浓度1×Proteinase Inhibitor Cocktail；-20℃保存。

Mouse IgG：即用型；用于小鼠来源IP抗体的阴性对照，-20℃保存。

Rabbit IgG：即用型；用于兔来源IP抗体的阴性对照，-20℃保存。

IPKine™ HRP, Goat Anti-Mouse IgG LCS：HRP标记的山羊抗小鼠IgG轻链二抗，建议稀释比例1:1,000-1:10,000（推荐1:2,000）；-20℃保存。

IPKine™ HRP, Mouse Anti-Rabbit IgG LCS：HRP标记的小鼠抗兔IgG轻链二抗，建议稀释比例1:1,000-1:10,000（推荐1:2,000）；-20℃保存。

实验步骤

一、免疫沉淀

A. 蛋白样品的准备

1. 细胞蛋白提取：
   1. (1) 细胞收集（贴壁细胞：10 cm培养皿中80%-90%单层细胞长满，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次；悬浮细胞：离心收集5×10⁶细胞，PBS洗涤一次）。
   2. (2) 0.5-1 mL Non-Denaturing Lysis Buffer（Non-Denaturing Lysis Buffer中加入终浓度1×Proteinase Inhibitor Cocktail）加到细胞中，4℃裂解细胞5 min，期间用移液器反复吹打，然后将细胞悬浮液转移到新的离心管中。
   3. (3) 12,000 rpm，4℃，离心10 min，收集上清，然后采用BCA法测定蛋白浓度（推荐使用Abbkine货号：KTD3001蛋白质定量试剂盒（BCA法））。
2. 组织蛋白提取：
   1. (1) 植物或动物组织样品：称取0.1-1 g组织，加入Non-Denaturing Lysis Buffer（Non-Denaturing Lysis Buffer中加入终浓度1×Proteinase Inhibitor Cocktail），液氮或匀浆器研磨。（若需要提高蛋白浓度，可以适量减少Non-Denaturing Lysis Buffer用量）。
   2. (2) 将匀浆液转移至新的离心管中，4℃冰上裂解5 min。
   3. (3) 12,000 rpm，4℃，离心10 min，收集上清，然后采用BCA法测定蛋白浓度（推荐使用Abbkine货号：KTD3001蛋白质定量试剂盒（BCA法））。

注意：总蛋白浓度选择在0.5-1 μg/μL范围内较为合适。通常针对目标蛋白的表达量不同，需要对总蛋白浓度进行预实验调整。免疫共沉淀（Co-IP）通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品，但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。

B. (可选做)去除非特异性结合：

1. (1) 取20 μL Protein A/G Magnetic Beads加入到1.5 mL离心管中，离心管置于磁分离架上，静置10 s，吸弃上清。

注意：Protein A/G Magnetic Beads使用前一定要充分重悬，即充分颠倒若干次使混合均匀。

2. (2) 加入1 mL 1×Wash Buffer，重置Protein A/G Magnetic Beads，离心管置于磁分离架上，静置10 s，吸弃上清，重复3次。
3. (3) 加入0.2-1 mL（0.2-1 mg）蛋白样品，4℃摇转孵育30 min。（推荐用垂直旋转混合仪，低速旋转）
4. (4) 离心管置于磁分离架上，静置10 s，取上清用于后续的免疫沉淀。

C. 免疫沉淀

1. (1) 取20 μL Protein A/G Magnetic Beads加入到1.5 mL离心管中，离心管置于磁分离架上，静置10 s，吸弃上清。
2. (2) 加入1 mL 1×Wash Buffer，重置Protein A/G Magnetic Beads，离心管置于磁分离架上，静置10 s，吸弃上清，重复3次。
3. (3) 加入0.2-2 μg抗体溶液，重置Protein A/G Magnetic Beads，室温下置于垂直旋转混合仪孵育30 min，离心管置于磁分离架上，静置10 s，收集上清液，沉淀用于后续Step (4)。

可选做，IgG阴性对照：加入0.2-2 μL Mouse IgG或Rabbit IgG，重置Protein A/G Magnetic Beads，室温下置于垂直旋转混合仪孵育30 min，离心管置于磁分离架上，静置10 s，收集上清液，沉淀用于后续IgG。此步可排除IgG本身和目的蛋白或其它特定生物分子的非特异性结合。

注意：Protein A/G Magnetic Beads置于垂直旋转混合仪混匀时，要保证有一定的流动性，若不流动，加入一定量的1×Wash Buffer。

4. (4) 加入1 mL 1×Wash Buffer，重置Protein A/G Magnetic Beads，离心管置于磁分离架上，静置10 s，吸弃上清，重复3次。
5. (5) 加入0.2-1 mL（0.2-1 mg）蛋白样品或上清（去除非特异性结合蛋白的上清），在室温下置于垂直旋转混合仪孵育1 h或4℃过夜。
6. (6) 离心管置于磁分离架上，静置10 s，收集上清液，沉淀用于后续Step (7)。
7. (7) 加入1 mL 1×Wash Buffer，重置Protein A/G Magnetic Beads，离心管置于磁分离架上，静置10 s，吸弃上清，重复3次。
8. (8) 洗脱
   1. a）变性洗脱法：此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE和Western Blotting检测。向离心管中加入20-50 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，100℃加热5 min，然后800 rpm离心1 min，收集上清液，进行SDS-PAGE和Western Blotting检测分析。
   2. b）非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向离心管中加入20-50 μL Elution Buffer混匀，然后在室温下孵育10 min，4℃，800 rpm离心1 min，收集上清液至新的离心管中，并立即加入1/10体积的Neutralization Buffer，将洗脱组分pH调节至7.0-8.0，用于后续功能分析。

二、免疫共沉淀：

参考免疫沉淀的方法进行。

FAQ

1. 1. IP试剂盒中有变性蛋白裂解液和非变性蛋白裂解液，实验中该如何运用？

   A: 在IP实验验证中，Input样本直接用于SDS-PAGE和WB实验，可用变性裂解液处理；而运用到IP/Co-IP实验操作中的样品，需要保持蛋白的活性，建议用非变性裂解液处理。

2. 2. 说明书免疫沉淀部分，步骤（3）（6）中，为何要收集上清，不是只需要沉淀用于后续步骤吗？

   A: 为了更好的分析实验结果，我们建议保留IP过程中的上清，并对其进行WB上样，以检验IP过程中磁珠与捕获抗体，样本与捕获抗体的结合情况，进而指导后续实验。

3. 3. 实验中IgG阴性对照的意义是什么？

   A: IgG理论上并不能特异性的与任何蛋白结合，用IgG捕获抗体相同物种来源的同型IgG作为抗体的阴性对照，可以用于排除样本中非特异性与IgG结合的蛋白，消除样本背景。

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