NAD⁺/NADH含量检测实验步骤详解：辅酶Ⅰ含量检测试剂盒完整操作指南
收到KTB1020辅酶Ⅰ含量检测试剂盒之后，建议先通读一遍这篇指南再动手。这篇不是说明书的逐字翻译——说明书给的是标准流程，这篇额外告诉你每个关键节点容易在哪里出问题，以及出了问题该往哪里排查。
开始之前：几件必须提前确认的事
正式实验之前有几个准备动作，跳过任何一个都可能导致实验当天返工。
确认试剂盒组分完整。 KTB1020包含：Assay Buffer、EtOH Solution、WST-8、Enhancer、NAD Cycling Enzyme Mix、NAD Standard（10 mM液体）、NAD Extraction Buffer、NADH Extraction Buffer，共8个组分。收货后逐一核对，确认WST-8、Enhancer、NAD Cycling Enzyme Mix这三个需要-20℃避光保存的组分没有在运输过程中反复解冻（冰袋运输，正常情况下没问题，但如果收货时冰袋已经完全融化，建议联系售后确认）。
提前预热酶标仪。 酶标仪需要预热30 min以上才能稳定在450 nm波长，这一步经常被忽略，导致实验进行到读数阶段才发现仪器还没准备好。建议在开始样本制备之前就启动酶标仪预热。
做预实验，不要跳过。 如果是第一次用这个试剂盒，或者换了新的样本类型，强烈建议用2–3个预期差异较大的样本先跑一次预实验。目的是确认样本信号落在0.78–50 µM的线性区间内。预实验信号过高（超出50 µM标准品的读数），正式实验时需要稀释样本；信号过低（ΔA低于0.01），需要增加起始样本量。这两个问题在预实验里发现，比在正式实验里发现要好处理得多。
想好要测什么。 这款试剂盒可以单独测NAD⁺、单独测NADH，或者两者都测再算比值。想测比值的话，同一份样本需要分成两管，分别用NAD Extraction Buffer（提NAD⁺）和NADH Extraction Buffer（提NADH）处理，提前估算好需要的样本起始量。
做好安全防护。 提取缓冲液含有一定化学刺激性，实验全程请穿戴实验服、手套和护目镜，在通风橱内进行样本制备操作。
试剂准备
各组分使用前处理
| 组分 | 使用前处理 | 实验中注意事项 |
|---|---|---|
| Assay Buffer | 平衡到室温 | 4℃保存 |
| EtOH Solution | 平衡到室温 | 4℃保存 |
| WST-8 | 直接使用 | 冰上避光放置；未用完分装后-20℃避光保存，禁止反复冻融 |
| Enhancer | 直接使用 | 冰上避光放置；未用完分装后-20℃避光保存，禁止反复冻融 |
| NAD Cycling Enzyme Mix | 直接使用 | 冰上避光放置；未用完分装后-20℃避光保存，禁止反复冻融 |
| NAD Standard（10 mM） | 直接使用，开管即用 | 冰上避光放置；未用完分装后-20℃避光保存1个月，禁止反复冻融 |
| NAD Extraction Buffer | 平衡到室温 | 4℃保存 |
| NADH Extraction Buffer | 平衡到室温 | 4℃保存 |
各组分开盖前先低速离心，避免管壁和管盖上残留的液体损失。WST-8、Enhancer、NAD Cycling Enzyme Mix这三个组分在实验全程保持冰上避光——不是说需要放一块冰在旁边意思一下，是真的要在遮光条件下操作，光照会导致WST-8非酶促自发还原，抬高背景噪声。
标准品配制
NAD Standard是即用型10 mM液体，无需复溶，但需要按以下梯度稀释配制工作液：
取5 µL的10 mM NAD Standard，加995 µL Assay Buffer，配成1 mL 50 µM NAD预混液。然后按下表稀释：
| 序号 | 取上一步稀释液（µL） | 加Assay Buffer（µL） | 终浓度（µM） |
|---|---|---|---|
| 1 | 400 µL（50 µM原液） | 0 | 50 |
| 2 | 200 µL（取自#1） | 200 | 25 |
| 3 | 200 µL（取自#2） | 200 | 12.5 |
| 4 | 200 µL（取自#3） | 200 | 6.25 |
| 5 | 200 µL（取自#4） | 200 | 3.13 |
| 6 | 200 µL（取自#5） | 200 | 1.56 |
| 7 | 200 µL（取自#6） | 200 | 0.78 |
| 空白 | 0 | 200 | 0 |
稀释后的标准品不稳定，必须在4小时内使用，不要提前一天配好放着。每次实验都需要重新做标准曲线，不能沿用上次的数据。
样本制备
这是整个实验流程里对结果影响最大的环节。NAD⁺和NADH对温度和pH都极度敏感，样本从离体到加入提取缓冲液的时间越短越好，全程在冰上操作。
提取逻辑在这里再明确一次：NAD Extraction Buffer是酸性的，保护NAD⁺、破坏NADH；NADH Extraction Buffer是碱性的，保护NADH、破坏NAD⁺。两种缓冲液绝对不能用错，加错了不是数据偏低，是目标分子在提取阶段就已经降解，后续检测到的信号没有意义。
组织样本
起始量：约20 mg新鲜组织。
提取NAD⁺的流程：
- 用预冷PBS在冰上洗涤组织，吸干表面液体
- 称重后立即用剪刀在冰上剪碎（动作要快，不要在室温下慢慢操作）
- 置于匀浆器中，加入100 µL NAD Extraction Buffer，充分匀浆
- 煮沸5 min（盖紧离心管盖，防止水分散失）
- 立即放回冰上，加入20 µL Assay Buffer和100 µL NADH Extraction Buffer中和提取物
- 4℃，14000 rpm离心5 min
- 吸取上清转移至新离心管，冰上待测
提取NADH的流程：
步骤与上面相同，但第3步换用100 µL NADH Extraction Buffer匀浆，第5步中和时换用100 µL NAD Extraction Buffer。其余步骤完全一致。
关于组织取材：如果取材和提取不在同一时间进行，组织取材后应立即投入液氮淬灭，在冷冻状态下称重，然后直接转入冰上的匀浆体系。在室温下放置哪怕几分钟，缺氧导致的NADH积累会让NAD⁺/NADH比值系统性偏移，数据质量无法保证。
细胞或细菌样本
起始量：约1×10⁶个细胞或细菌。
提取NAD⁺的流程：
- 收集细胞或细菌，用冷PBS洗涤（低速离心5 min，弃上清）
- 加入100 µL NAD Extraction Buffer
- 冰浴超声破碎5 min（功率20%或200 W，超声3 s，间隔7 s，重复30次）。注：上述参数基于常见探头式超声破碎仪，不同品牌和型号的实际输出功率差异较大，首次使用建议先用少量样本摸索合适功率。超声全程保持冰浴，防止样品升温——样品温度升高对NAD/NADH的破坏比破碎不充分更难补救。
- 煮沸5 min（盖紧）
- 立即放回冰上，加入20 µL Assay Buffer和100 µL NADH Extraction Buffer中和
- 4℃，14000 rpm离心5 min
- 上清转移至新离心管，冰上待测
提取NADH的流程：
第2步换用100 µL NADH Extraction Buffer，第5步中和时换用100 µL NAD Extraction Buffer，其余步骤相同。
关于细胞收集速度：吸走培养基后，后续操作要尽量压缩时间。如果同时处理多个样本，建议分批操作而不是一次性处理所有样本，确保每个样本从离心到加提取液之间的时间间隔尽量短。
血清（浆）样本
起始量：约20 µL血清（浆）。
提取NAD⁺的流程：
- 吸取约20 µL血清（浆）
- 加入100 µL NAD Extraction Buffer
- 煮沸5 min（盖紧）
- 立即放回冰上，加入20 µL Assay Buffer和100 µL NADH Extraction Buffer中和
- 4℃，14000 rpm离心5 min
- 上清转移至新离心管，冰上待测
提取NADH的流程：
第2步换用100 µL NADH Extraction Buffer，第4步中和时换用100 µL NAD Extraction Buffer。
血清（浆）样本不需要匀浆和超声步骤，操作相对简单，但同样需要注意样本从-80℃取出后在冰上融化，不要在室温下等待融化。
检测体系配制与上机
工作液配制
每孔需要85 µL工作液，现配现用，不要提前配好放置。
按以下比例混合（以配制一次实验所需总量为准，按孔数计算好再配）：
| 组分 | 每孔用量 |
|---|---|
| Assay Buffer | 68 µL |
| NAD Cycling Enzyme Mix | 1 µL |
| WST-8 | 5 µL |
| Enhancer | 1 µL |
| （以上混合后室温孵育5 min） | — |
| EtOH Solution | 10 µL |
注意加入顺序：前四个组分混合后，室温孵育5 min，再加入EtOH Solution。EtOH是驱动循环反应的底物，提前加入会让反应在加样之前就开始，导致背景偏高。
96孔板加样
| 试剂 | 空白孔（µL） | 标准孔（µL） | 测定孔（µL） |
|---|---|---|---|
| Assay Buffer | 40 | 0 | 0 |
| 标准品工作液（不同浓度） | 0 | 40 | 0 |
| 样本 | 0 | 0 | 40 |
| 工作液 | 80 | 80 | 80 |
工作液加入要迅速，加完后立即充分混匀。这是说明书里特别强调的操作，原因在于酶催化的动力学反应从工作液接触样本的那一刻就开始计时，各孔之间的时间差会引入系统误差。建议使用多通道移液器，减少各孔之间的加样时间差。
标准孔和空白孔一般只做1次，不需要重复。测定孔根据实验设计决定是否做复孔。
吸光度检测
加样混匀后，室温孵育30 min，然后在450 nm处读取各孔吸光值，分别记为A空（空白孔）、A标（标准孔）、A测（测定孔）。
KTB1020是终点法，只需要一次读数：孵育结束后统一读值，无需在加样后立即读第一个时间点。
计算时：ΔA标 = A标 - A空，ΔA测 = A测 - A空。
和KTB1010的区别：KTB1010（NADP/H试剂盒）是动力学差值法，需要在加样混匀后立即读A1，孵育30 min后再读A2，用ΔA = A2 - A1计算。KTB1020不需要这样。如果两块板同时在跑，操作节奏务必分开，不要混淆。
结果计算
标准曲线绘制
以标准品浓度（µM）为y轴，ΔA标为x轴，在Excel或其他软件里绘制线性回归曲线，得到方程 y = kx + b。
将各测定孔的ΔA测代入方程，得到y值，即样本提取液中的NAD⁺或NADH浓度（µM）。
典型标准曲线参考：y = 30.348x - 0.3208，R² = 0.9978（说明书提供，每次实验建议自建）。
换算为样本含量
根据实验目的选择对应的计算方式：
按样本质量（适用于组织样本）
NAD或NADH（nmol/g鲜重）= 0.22 × y ÷ W × n
W = 样本质量（g）；n = 样本稀释倍数（未稀释时n=1）
按蛋白浓度（适用于需要归一化的组织或细胞样本）
NAD或NADH（nmol/mg prot）= y ÷ Cpr × n
Cpr = 样本蛋白质浓度（mg/mL）；推荐用BCA法定量（Abbkine KTD3001）
按细胞或细菌数量
NAD或NADH（nmol/10⁴细胞）= 0.22 × y ÷ N × n
N = 细胞或细菌数量（以10⁴为单位，例如1×10⁶个细胞时N=100）
按液体体积（适用于血清浆样本）
NAD或NADH（nmol/mL）= 12 × y × n
比值计算
如果同时测了NAD⁺和NADH，比值计算：
NAD⁺/NADH = NAD⁺含量 ÷ NADH含量
计算的两个数值要用相同单位、相同归一化方式。
结果解读提示：测出来的是提取物中的总NAD⁺和总NADH（游离态+蛋白结合态），不是细胞内游离辅酶的真实浓度。在文章方法描述和结果讨论里，用"total NAD⁺/NADH"或"intracellular NAD⁺/NADH levels"来表述，不要写成"free NAD⁺/NADH ratio"。
常见问题排查
读数偏高（超出标准曲线上限）
将样本用去离子水稀释（例如2倍或5倍），重新检测，最终结果乘以稀释倍数。
读数偏低（ΔA测低于0.01）
可能原因：起始样本量不足、辅酶在制备过程中降解、提取缓冲液加错。首先确认样本量是否达到建议起始量，然后回溯样本制备的操作速度和温度控制是否到位。
标准曲线线性差（R²低于0.99）
可能原因：标准品稀释时移液不准确、标准品已经降解（超过4小时未使用或反复冻融）、工作液配制顺序有误。重新配制标准品和工作液。
孔间重复性差
最常见原因是工作液加入不够迅速或混匀不充分。建议换用多通道移液器，加样后用振板混匀代替手动吹打。
样本组之间NAD⁺/NADH比值差异不如预期
首先排查样本制备速度——如果不同处理组的样本离体到加提取液的时间间隔不一致，系统性误差可能掩盖真实的组间差异。确保所有组的样本在相同操作条件下处理。
配套推荐
如果实验设计需要对结果做蛋白浓度归一化（推荐方式），可以同批次用KTD3001（BCA蛋白定量试剂盒）完成蛋白定量，两个检测可以使用同一批裂解样本的分管。
如果课题同时需要NADP⁺/NADPH数据，可以平行使用KTB1010（辅酶Ⅱ NADP(H)检测试剂盒），两套试剂盒的检测体系互不干扰，同批次运行，操作节奏上注意KTB1010需要两次读数这个区别。
相关延伸检测：
- KTB1021：NADH氧化酶（NOX）活性检测，适合关注NADH消耗速率的课题
- KTB1022：NAD激酶（NADK）活性检测，适合研究NAD→NADP转化通量的课题
