查尔酮异构酶(CHI)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 381 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 水浴锅、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Reagent II：临用前配制；48 T加入 12 mL ReagentⅠ，96 T加入 24 mL ReagentⅠ，充分溶解。用不完的试剂 4℃避光保存 1个月。

注意：Extraction Buffer有刺激性气味，Reagent II 有毒，建议在通风橱进行实验。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 381 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 96孔 UV板或微量石英比色皿中操作）：

3. 充分混匀，记录 381 nm处 10 s时吸光值 A1，37℃反应 30 min记录 30 min 10 s时的吸光值 A2。计算ΔA=A2-A1。

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.05可适当加大样本量。如果ΔA大于 0.8，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

CHI活性的计算

(1) 按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每毫克蛋白在每毫升反应体系中每小时 A381变化 0.05定义为一个酶活力单位。

CHI (U/mg prot)=ΔA×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T÷0.05=800×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每克样本在每毫升反应体系中每小时 A381变化 0.05定义为一个酶活力单位。

CHI (U/g 鲜重)=ΔA×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T÷0.05=800×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，0.2 mL；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，0.5 h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。