维生素E(VE)含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 530 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、离心机、涡旋震荡仪
• 去离子水
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Reagent IV：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

样本制备

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，匀浆后用 Extraction Buffer定容至 1 mL，在漩涡震荡仪上震荡 5 min，于 5,000 g，25℃离心 10 min，取上清液待测。
2. 细胞：收集 500万细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞 3 min（功率 300 W，超声 3 s，间隔 7 s，总时间 3 min），然后在漩涡震荡仪上震荡 5 min，于 5,000 g，25℃离心 10 min，取上清液待测。
3. 血清（浆）等液体样本：取 0.1 mL，加 0.9 mL Extraction Buffer，漩涡仪震荡上震荡 5 min，于 5,000 g，25℃离心 10 min，取上清液待测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min，调节波长到 530 nm。可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：

结果计算

A. 用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下

标准条件下测定回归方程为：y=0.22x+0.0065, R²=0.9978；x为标准品（μg/mL），y为ΔA。

（1）按照蛋白含量计算

VE (μg/mg prot)=(ΔA-0.0065)÷0.22×V 反总÷(V 样×Cpr)=9.09×(ΔA-0.0065)÷Cpr

（2）按照样本质量计算

VE (μg/g 鲜重)=(ΔA-0.0065)÷0.22×V 反总÷(V 样×W÷V 样总)=9.09×(ΔA-0.0065)÷W

（3）按照细胞数量计算

VE (μg/10⁴ cell)=(ΔA-0.0065)÷0.22×V 反总÷(V 样×N÷V 样总)=9.09×(ΔA-0.0065)÷N

（4）按照液体体积计算

VE (μg/mL)=(ΔA-0.0065)÷0.22×V 反总÷V 样×10=90.9×(ΔA-0.0065)

V 反总：反应总体积，0.2 mL；V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞数量，万。

B. 用 96孔板测定的计算公式如下

标准条件下测定回归方程为：y=0.11x+0.0065, R²=0.9978；x为标准品（μg/mL），y为ΔA。

（1）按照蛋白含量计算

VE (μg/mg prot)=(ΔA-0.0065)÷0.11×V 反总÷(V 样×Cpr)=18.18×(ΔA-0.0065)÷Cpr

（2）按照样本质量计算

VE (μg/g 鲜重)=(ΔA-0.0065)÷0.11×V 反总÷(V 样×W÷V 样总)=18.18×(ΔA-0.0065)÷W

（3）按照细胞数量计算

VE (μg/10⁴ cell)=(ΔA-0.0065)÷0.11×V 反总÷(V 样×N÷V 样总)=18.18×(ΔA-0.0065)÷N

（4）按照液体体积计算

VE (μg/mL)=(ΔA-0.0065)÷0.11×V 反总÷V 样×10=181.8×(ΔA-0.0065)

V 反总：反应总体积，0.2 mL；V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞数量，万。

注意事项

1. 离心后，在吸取上层正庚烷抽提液时，切勿将中间无水乙醇与水的液相层吸入，以免影响试验结果。
2. 比色皿需用无水乙醇冲洗，勿用去离子水以防出现分层影响试验数据。
3. 显色结束后尽快完成测定。