一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(红色荧光)

自备耗材

• 离心机，荧光显微镜
• 96孔细胞板，可调节式移液枪及枪头，10mM Tris pH7.5，磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）
• 4%多聚甲醛，去离子水，组织自发荧光淬灭剂

试剂准备

Working Label Mix Red：根据实际用量，用 Probe Diluent将 Label Mix Red稀释 20倍得到 Working Label Mix Red，未用完的 Working Label Mix Red于-20℃避光分装保存 3个月，避免反复冻融。

DAPI (1×)：根据实际用量，用 PBS将 DAPI (500×)稀释成 DAPI (1×)。

TritonX-100 (0.3%)：根据实际用量，用 PBS将 100% TritonX-100稀释成 0.3% TritonX-100。

1×Equilibration Buffer：流式细胞仪分析需制备 1×Equilibration Buffer，根据实际用量，用去离子水将 5×Equilibration Buffer稀释成 1×Equilibration Buffer。

1×DNase I Buffer：根据实际用量，用去离子水将 10×DNase I Buffer稀释成 1×DNase I Buffer。

实验步骤

A. 样本制备

1. 对于贴壁细胞（通过荧光显微镜分析）

1. (1) 在 96孔板进行细胞培养，至少 24 h。通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照组细胞。
2. (2) 除去培养基，在室温下用 50 µL 4%多聚甲醛固定细胞 30 min。
3. (3) 除去固定液并用 200 µL PBS浸洗 3次，每次 5 min。
4. (4) 固定后，每孔添加 50 µL 0.3%Triton X-100，并在室温下孵育 30 min。
5. (5) 除去通透剂，用 50 µL BSA Working Solution洗涤细胞 3次。进行荧光显微镜分析（继续进行步骤 B.1）。

注意：对于细胞爬片及其他孔板细胞，可依据实际情况调整固定液和通透剂体积。

2. 对于非贴壁细胞（通过流式细胞仪分析）

1. (1) 培养细胞至最佳密度（约 1-2×10⁶细胞/mL），通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照培养物。
2. (2) 以 300 g离心并收集细胞（1-5×10⁶），用 PBS洗涤 2次。
3. (3) 加入 1 mL 4%多聚甲醛，在室温下孵育 30 min。
4. (4) 以 300 g离心细胞，除去上清液，重悬于 1 mL PBS中，重复洗涤 2次。
5. (5) 以 300 g离心细胞，除去上清液，在室温下，用 500 µL 0.3% Triton-X 100重悬细胞 5 min使其通透（或者将细胞在 100 µg/mL蛋白酶 K的 PBS中重悬 5 min使其通透）。
6. (6) 以 300 g离心细胞，除去上清液，重悬于 1 mL PBS中。重复洗涤 2次，然后进行流式细胞仪分析（继续进行步骤 B.2）。

3. 对于石蜡包埋的组织切片（通过荧光显微镜分析）

1. (1) 将组织在二甲苯浸泡 2次，每次 10-20 min进行脱蜡。
2. (2) 通过以下步骤（按给定顺序）为组织复性：在 100%乙醇中 2次洗涤 5 min，然后依次在 95%，70%和 50%乙醇中洗涤 3 min。
3. (3) 用适量的 PBS浸洗样品 2次，每次 5 min。
4. (4) 排出组织中多余的 PBS，并在 20 µg/mL蛋白酶 K（在 10mM Tris pH7.5中，现配现用）溶液中室温孵育 15 min。

注意：必须针对特定组织类型和厚度优化蛋白酶消化时间。蛋白酶过度消化将导致细胞结构丧失，组织切片可能会从玻片上脱落。消化不充分会导致 TdT标记不彻底。

5. (5) 用适量的 PBS浸洗样品 3次，每次 5 min来终止蛋白酶消化作用，进行荧光显微镜分析（继续进行步骤 B.1）。

4. 对于冰冻组织切片（通过荧光显微镜分析）

1. (1) 将切片在玻片上干燥后，在室温下用 200 µL 4%多聚甲醛固定 30 min。
2. (2) 用适量的 PBS浸洗 2次，每次 5 min。
3. (3) 去除组织中多余的 PBS，并在 20 µg/mL蛋白酶 K（在 10mM Tris pH7.5中，现配现用）溶液中室温孵育 15 min。
4. (4) 用适量的 PBS浸洗样品 3次，每次 5 min来终止蛋白酶消化作用，进行荧光显微镜分析（继续进行步骤 B.1）。

注意：1. 组织切片会产生自发荧光，可使用组织自发荧光淬灭剂进行处理。2. 阳性对照的设置（可选），A步骤完成后，在室温条件下可用 10 U/mL的 DNase I（用 1×DNase I Buffer将 5 U/µL的 DNase I稀释成 10 U/mL）消化细胞或组织 10-20 min后，样本用 PBS洗涤 3次，每次 5min，然后再进行荧光显微镜分析，如果是组织切片样本，建议阳性对照后续操作在单独的染色缸中染色和洗涤。

B. TUNEL分析

1. 荧光显微镜分析

1. (1) 根据要分析的样品数量，在使用前准备 TdT 标记反应缓冲液：

注意：配制 TdT标记反应缓冲液之前，将各组分平衡至室温，Equilibration Buffer (5×)母液因低温保存，会出现少量成分析出的现象，请颠倒混匀后使用。Equilibration Buffer (5×)中含有高毒性化学物质二甲胂酸钠和氯化钴，皮肤接触后，立即用大量水冲洗。万一发生事故或感到不适，请立即就医。使用时请勿饮酒，饮食或吸烟。

2. (2) 向每个样品中加入 50 µL（96孔板推荐 50 µL，24孔板推荐 200 µL，切片建议添加 100-200 µL盖住组织即可）反应混合物，并在湿盒中 37℃下避光孵育 2 h (不同的样本，可视情况调整孵育时间)。
3. (3) 用 PBS 将样品浸洗 3次，每次 5 min。
4. (4) 用 1×DAPI孵育 10 min对样品进行复染。

注意：如需计算凋亡细胞比例，建议复染，根据染色组织的不同，复染浓度可能需要调整。DAPI过度染色可能导致难以观察荧光素标记。

5. (5) 用适量的 PBS 浸洗样品 3次，每次 5 min。
6. (6) 对于细胞爬片、石蜡切片和冰冻切片等样本，可加入水性封固剂或抗荧光淬灭剂，封住盖玻片，用荧光显微镜进行观察。对于孔板、培养皿内细胞样本，加入适量 PBS浸没细胞，再进行荧光显微镜拍照观察，红色通道（Ex/Em=555 nm/565 nm）。

显微镜拍照技巧：1）使用 DAPI通道查找细胞位置；2）阴性对照组优先拍照，阴性对照显示荧光为非特异性染色荧光，需要通过黑白平衡进行扣除至无荧光；3）实验组或阳性组拍照，扣除与对照相同的黑白平衡，得到实验组或阳性组有效荧光。

2. 流式细胞仪分析

1. (1) 将细胞重悬于 100 µL 1×Equilibration Buffer中，在室温下避光孵育 10 min。
2. (2) 300 g离心细胞，除去上清液，重悬于 50 µL TdT标记反应缓冲液中，在 37℃下孵育 2 h (不同的样本，可视情况调整孵育时间)，孵育期间可定时轻轻地晃动以混匀细胞。
3. (3) 300 g离心细胞。除去上清液，重悬于 1 mL PBS中。重复洗涤 2次。
4. (4) 重悬于 200 µL 1×DAPI中，孵育 10 min。
5. (5) 通过流式细胞仪分析细胞。

FAQ

1. 1. 做 TUNEL凋亡检测，需要抗原修复或者冰冻修复吗？

   需要先固定细胞，不需要做抗原修复，本试剂盒标记的是细胞核内的断裂基因，而不是抗原蛋白。

2. 2. TUNEL检测可以和免疫荧光（IF）一起双染吗？先后顺序在怎样的？

   可以和 IF进行共染，建议先做 TUNEL检测，再做 IF。

3. 3. 本品是否可以替代吖啶橙染色试剂盒？

   可以，吖啶橙染色试剂盒组分存在致癌性，所以用 TUNEL试剂盒进行凋亡检测安全性更高。