胞浆异柠檬酸脱氢酶(ICDHc)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、制冰机、离心机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

Working Solution：临用前配制，将 ReagentⅡ转移至 ReagentⅠ中，充分溶解。配制好的Working Solution 4℃可保存一个月。

Working Reagent III：临用前配制，对于 48 T试剂盒，向 Reagent III 加入 0.6 mL去离子水充分溶解粉剂；对于 96 T试剂盒，向 Reagent III 加入 1.2 mL去离子水充分溶解粉剂；未用完的试剂-20℃分装避光可保存两周，避免反复冻融。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞或细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）：直接测定。

如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。该试剂盒提取的样本也可以适用于 KTB1120、KTB1341的测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。
2. Working Solution于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 10 min。
3. 在 96孔 UV板或微量石英比色皿中依次加入 10 µL样本、180 µLWorking Solution和 10 µLWorking Reagent III，迅速混匀后于 340 nm检测，记录 20 s和 2 min 20 s的吸光值，分别记为 A1和 A2，计算ΔA=A2-A1。

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.01可适当加大样本量或延长反应时间到 5 min或10 min。如果ΔA大于 0.5，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。因通过单位时间内吸光值变化计算酶活，不推荐同时测多个样本。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

使用 96孔 UV板测定的计算公式如下

1. 血清（浆）中 ICDHc活力的计算:

单位的定义：每mL血清（浆）每分钟生成 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

ICDHc (U/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷V 样÷T=3,216×ΔA

2. 组织、细菌或细胞中 ICDHc活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

ICDHc (U/mg prot)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V 样)÷T=3,216×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟生成 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

ICDHc (U/g鲜重)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样÷V 样总×W)÷T=3,216×ΔA÷W

（3）按细胞或细菌计算：

单位的定义：每 10⁴个细胞或细菌每分钟生成 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

ICDHc (U/10⁴)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样÷V 样总×500)÷T=3,216×ΔA÷500=6.432×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔 UV板光径，0.5 cm；10⁹：1 mol=1×10⁹ nmol；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；500：细胞或细菌总数，5×10⁶。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。