ABTS自由基清除能力检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 734 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 低温离心机、制冰机
• 去离子水、95%乙醇
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前预冷；4℃保存。

ReagentⅠStock Solution：使用前 24 h配制；取一瓶 ReagentⅠ加入 5 mL去离子水充分溶解，室温避光放置 24 h后使用；用不完的试剂 4℃避光可保存三天。

注意：Reagent I 量少，肉眼不可见，请勿倾倒，溶解后为黑绿色溶液。

Working Reagent I：临用前配制；根据用量，将 ReagentⅠStock Solution用 95%乙醇稀释 50倍，现配现用，在 30 min内使用。

Vitamin C Working Reagent (Positive Control)：临用前配制；加入 1 mL去离子水，充分溶解，配制成 10 mg/mL的维生素 C溶液，4℃避光可保存两周，用于阳性对照。

阳性对照的准备：若需要线性关系，建议先将 10 mg/mL的 Vitamin C Working Reagent用去离子水稀释 10倍成 1 mg/mL，然后配制成 0.1、0.05、0.025、0.0125、0.0063、0.0031、0.0016 mg/mL的维生素 C溶液待用，稀释可参考下表：

注意：每次实验都要做一次标准品检测，制作标曲；稀释后的标准品溶液不稳定，必须在 4小时内使用。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。

1. 植物样本的制备：称取约 0.1 g组织，加入 1 mL Extraction Buffer进行冰浴匀浆，然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清，置于冰上待测。
2. 红酒、果汁等液体样本：吸取 100 μL样本溶液加入 900 μL Extraction Buffer，旋涡振荡混匀，然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清，置于冰上待测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min，调节波长到 734 nm。可见分光光度计用去离子水调零。

2. 操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中进行）：

充分混匀，室温避光反应 5 min后测定 734 nm处吸光值，分别记为 A 测定、A 空白、A 阳性对照。

注意：阳性对照孔和空白孔只需测 1-2次。不同样本清除 ABTS自由基的能力可能相差很大，实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果清除率小于 5%，可适当加大样本量，比如加大液体样本体积；如果清除率大于 90%，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 阳性对照的自由基清除率计算公式：

   ABTS自由基清除率（DVC%）=[(A 空白-A 阳性对照)÷A 空白]×100%

2. 样本的自由基清除率计算公式：

   ABTS自由基清除率（D%）=[(A 空白-A 测定)÷A 空白]×100%

注意事项

1. 尽量避免使用在碱性条件下呈蓝色或接近蓝色的样本，否则对本试剂盒的检测结果产生干扰。
2. 样品中不宜添加Tween、Triton和NP-40等去垢剂和DTT、巯基乙醇等影响氧化还原反应的还原剂。
3. 不同样本清除ABTS自由基的能力可能相差很大，如果要比较不同样本的ABTS自由基清除能力，建议加入等量的同一批样本进行检测。
4. 样本建议当天提取当天检测。