线粒体通透性转换孔(MPTP)检测试剂盒

自备耗材

• 细胞培养板、可调节式移液枪及枪头
• 离心机
• 荧光显微镜或流式细胞仪
• PBS

试剂准备

Calcein AM staining solution：每 1 mL Assay buffer 加入 1 μL Calcein AM (1000X)，混匀。

Fluorescence quenching solution：每 1 mL Calcein AM staining solution 加入 10 μL CoCl₂ (100×)，混匀。

Ionomycin control：每 1 mL Fluorescence quenching solution 加入 5 μL Ionomycin (200×)，混匀。

实验步骤

A. 流式细胞术检测

1. 用预期的方法处理细胞；
2. 对于非贴壁细胞，300 g离心5 min收集细胞，用PBS清洗2次，弃去PBS。对于贴壁细胞，先用胰蛋白酶（不含EDTA）消化细胞，然后300 g离心5 min离心收集细胞，用PBS清洗2次，弃去PBS。
3. 注意：需准备悬浮在Assay Buffer中的细胞样本，用于流式细胞检测时的阴性对照。
4. 分别加入适当体积的Calcein AM staining solution、Fluorescence quenching solution、Ionomycin control重悬细胞，使细胞密度约为1×10⁶/mL，37℃避光孵育30-45 min，不同的细胞最佳孵育时间有所不同。
5. 孵育完成后，300 g离心5 min收集细胞。每个样品加入1mL Assay Buffer，轻轻重悬，300 g离心5 min收集细胞。
6. 用400 μL Assay Buffer重悬细胞后，用流式细胞仪分析。

B. 荧光显微镜检测

对于贴壁细胞：

1. (1) 在合适的孔板上培养细胞，在CO₂细胞培养箱中37℃培养至少24 h，再进行后续实验。
2. (2) 用预期的方法处理细胞，在不含诱导剂条件下孵育细胞建立阴性对照组。
3. (3) 用PBS清洗细胞2次。
4. (4) 分别加入适当体积Calcein AM staining solution、Fluorescence quenching solution、Ionomycin control到细胞中，通常96孔板每孔加入100μL，24孔板每孔加入250 μL，12孔板每孔加入500 μL，6孔板每孔加入1 mL，37℃避光孵育30-45 min，不同的细胞最佳孵育时间有所不同。
5. (5) 孵育结束后，更换成新鲜的37℃预热的培养液，37℃再避光孵育30 min，以保证细胞内酯酶充分水解Calcein AM以生成有绿色荧光的Calcein。
6. (6) 用PBS清洗2-3次，然后加入Assay Buffer即可在荧光显微镜下观察（Calcein为绿色荧光，Ex/Em=494/517 nm）。

对于悬浮细胞：

1. (1) 用预期的方法处理细胞，计数。
2. (2) 取适当细胞300 g离心5 min，弃上清，用PBS清洗细胞2次，弃去PBS。
3. (3) 分别加入适当体积的Calcein AM staining solution、Fluorescence quenching solution、Ionomycin control重悬细胞，使细胞密度约为1×10⁶/mL，37℃避光孵育30-45 min，不同的细胞最佳孵育时间有所不同。
4. (4) 300 g离心5 min，吸除上清液，缓慢加入37℃预热的培养液重悬细胞，37℃再避光孵育30 min，以保证细胞内酯酶充分水解Calcein AM以生成有绿色荧光的Calcein。
5. (5) 300 g离心5 min，吸除大部分培养液，将细胞重悬后涂片，在荧光显微镜下观察。