超敏型细胞增殖检测试剂(CCK-8)-SuperKine™

自备耗材

• 酶标仪（能测 450 nm处的吸光值）及二氧化碳培养箱（37℃，5% CO2）
• 96孔细胞培养板，可调节式移液枪及枪头

试剂准备

即用型 CCK-8溶液：即用型，无需预混合组分。

实验步骤

注意：正式实验前，做预实验确定合适的细胞数量和孵育时间。若 OD值太高，可适当减少细胞数量、缩短加入 CCK-8的孵育时间或减少 CCK-8的上样量。

Ⅰ制作标准曲线

1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞；
2. 按比例依次用培养基等比稀释细胞，一般要做 5-7个细胞浓度梯度，每组 4-6个复孔；
3. 接种后培养贴壁细胞或悬浮细胞 0.5-4 h，每 100 μL培养基加 10 μL CCK-8试剂，培养一定时间后测定 OD450值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD450值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。使用此标准曲线的前提条件是试验条件完全一致。

Ⅱ 细胞活性检测

1. 在 96孔板中接种细胞悬液（100 μL/孔），将板在培养箱中预先培养；
2. 在每孔中加入 10 μL CCK-8溶液，注意不要将气泡引入孔中，因为它们会干扰 OD值读取；
3. 在培养箱中将平板孵育 0.5-4 h；时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定；
4. 使用酶标仪测量 450 nm处的吸光度。

Ⅲ 细胞增殖/毒性检测方案

1. 在 96孔板中接种 100 μL细胞悬液（5,000个细胞/孔），将板在培养箱中预培养 24 h；
2. 在平板中加入 1-10 μL各种浓度的待测物质；
3. 在培养箱中将平板孵育适当的时间（例如 6、12、24或 48 h）；
4. 向板的每个孔中加入 10 μL CCK-8溶液，注意不要将气泡引入孔中，因为它们会干扰 OD值读取；
5. 在培养箱中将平板孵育 0.5-4 h；时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定；
6. 使用酶标仪测量 450 nm处的吸光度。

结果计算

As：实验孔吸光度（含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液）；

Ac：对照孔吸光度（含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物）；

Ab：空白孔吸光度（含培养基、CCK-8 溶液，不含细胞、药物）。

注意事项

1. CCK-8对细胞的毒性相当低，因此细胞在 CCK-8法检测后还可用于其他后续分析。
2. 如果 OD值太低，可以采取适当增加细胞数量或者延长加入 CCK-8后的孵育时间的办法。
3. 试剂盒依赖于脱氢酶催化的反应，影响活细胞中脱氢酶活性的条件或化学物质如还原剂会干扰检测。如果由于长期培养而改变了培养基的颜色或 pH，请在添加 CCK-8时更换培养基。

FAQ

1. 该产品比较敏感，偶有 OD值偏高的现象，应该如何处理？

   从三个方面进行调整：（1）用不同数目的细胞进行检测，制作标准曲线，确定合适的细胞数目；（2）缩短加入 CCK-8的孵育时间；（3）减少 CCK-8的上样量，使 CCK-8稀释到合适浓度使用。

2. 如何判断本品的检测范围？

   建议用自己的不同的细胞个数先做标准曲线，根据稳定线性趋势，确定特定细胞的检测数量区间。

3. 细胞毒性实验如何设置？

   有两种设置方式：（1）100 μL细胞悬液中加入 1-10 μL各种浓度的待测物质，孵育适当时间后，再加入体系中 10%的溶液；（2）先将待检测物质作用细胞一段时间后，再利用 CCK-8检测细胞增殖情况。

4. OD 值在什么范围比较合适？

   答：一般情况下 OD值在 0.1-2.0都可以，在 1.0附近比较好。一般可将对照孔吸光度（含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物）的 OD值控制在 0.8-1.0左右，确定细胞的检测数量。