EdU法细胞增殖成像分析试剂盒(绿色荧光)

自备耗材

• 低温离心机
• 可调节式移液枪及枪头
• 去离子水
• 固定液（含 3.7%-4%甲醛或多聚甲醛的 PBS）
• 通透剂（含 0.5%Triton X-100的 PBS）

试剂盒组分

试剂制备

• EdU (10 mM)：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。
• BSA Wash Solution (1×)：向 BSA Wash Solution（5×）中添加磷酸盐缓冲液（PBS），将 5×母液稀释成 1×工作液（终浓度为 3% BSA），并混匀。使用后分装并保存在-20℃，该溶液可稳定保存 6个月。
• AbFluor 488 Azide：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。
• Reaction Buffer (10×)：即用型，使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Copper Reagent：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Reducing Agent (10×)的配制：向 Reducing Agent中添加去离子水配制终浓度为 100 mg/mL的 Reducing Agent（10×）并混合直至化合物完全溶解。使用后分装-20℃保存，该溶液可稳定保存 6个月。若溶液变成棕色，说明组分已经降解，不建议继续使用。
• Hoechst 33342 (1×)：临用前配制，用 PBS按 1：1,000的比例配成 1×Hoechst 33342工作液；分装，-20℃避光保存。
• Hydroxyurea：DNA合成抑制剂；即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

实验步骤

A. EdU标记培养细胞

本实验以 96孔板培养的贴壁细胞为例。悬浮细胞可在孵育 EdU后进行涂片处理（将适量细胞滴加到载玻片上，酒精灯烘烤至干燥），涂片后从固定开始与贴壁细胞采用相同的染色步骤。

1. 孔板内放入适配盖玻片，接种适量细胞，使其生长至所需密度后处理细胞；
2. 可选步骤：阴性对照的设置：EdU孵育前加入 DNA合成抑制剂 Hydroxyurea，按 1:1,000的比例直接加入到阴性对照孔内，混匀孵育 0.5 h；
3. 用 10 mM EdU溶液在培养基中制备 2×EdU工作溶液（20 µM）。推荐的 EdU终浓度为 10 µM，用细胞培养液 1:500稀释 10 mM EdU即可得到 2×EdU工作溶液（20 µM）；
4. 将预热（37℃）的 2×EdU溶液等体积添加到含有试验细胞的培养基中，使 96孔板中的 EdU终浓度变为 1×；

注意：建议不要更换所有培养基，因为这会影响细胞增殖速率；建议 EdU起始浓度是 10 µM。

5. 在最适合的条件下孵育细胞 2 h（根据细胞扩增时间确定，一般肿瘤细胞的孵育时间为 2 h）；
6. 孵育后除去培养基，并向每个孔中加入 0.1 mL固定液（含 3.7%-4%甲醛或多聚甲醛的 PBS），室温下孵育 15 min；
7. 除去固定液，用 0.1 mL BSA Wash Solution (1×)浸洗孔中细胞 5 min，重复 3次；
8. 除去洗涤液，向每个孔中加入 0.1 mL通透剂（含 0.5%Triton X-100的 PBS），室温下孵育 15 min；
9. 除去通透剂，用 0.1 mL BSA Wash Solution (1×)浸洗孔中细胞 5 min，重复 2次；
10. 转步骤 C。

B. EdU标记活体动物

本实验以 6周龄小鼠为例，其它动物体内 EdU的标记请参考相关文献。

1. 对于小鼠，可以按照 10-200 mg/kg的用量，把 EdU用 PBS配制成一定浓度，加入饮用水中。具体用量跟所用动物的种类、体重和使用方式有关，可以参考相关文献，因此初次使用时建议对 EdU的使用浓度进行一定的摸索，或者直接使用 50 mg/kg的浓度进行测试。如果之前使用过 BrdU进行实验，则可以参考 BrdU的终浓度作为 EdU的终浓度。EdU需单独购买；
2. 可选步骤：阴性对照的设置：EdU处理时加入 DNA合成抑制剂 Hydroxyurea，按 1000 mg/kg的浓度用 EdU溶液进行配制。Hydroxyurea需单独购买；
3. 24小时后或根据特定实验确定的适当时间后，快速处死小鼠，取出所需的组织，按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EdU标记的时间也可以参考相关文献自行调整；
4. 对于冰冻切片：
   1. 加入适量固定液（含 3.7%-4%甲醛或多聚甲醛的 PBS），室温下孵育 15 min；
   2. 除去固定液，用适量 BSA Wash Solution (1×)浸洗 5 min，重复 3次；
   3. 除去洗涤液，加入适量通透剂（含 0.5%Triton X-100的 PBS），室温孵育 15 min；
   4. 除去通透剂，用适量 BSA Wash Solution (1×)浸洗 5 min，重复 2次；
   5. 抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫荧光染色，并有必要进行抗原修复，可以使用适当的抗原修复液，或者自行配制的适当的抗原修复液进行抗原修复处理；
   6. 转步骤 C。
5. 对于石蜡切片：
   1. 脱蜡：二甲苯中脱蜡 5-10 min，换用新鲜的二甲苯，再脱蜡 5-10 min。组织复性：在无水乙醇中洗涤 5 min，换新的无水乙醇洗涤 3 min；然后依次在 95%、85%、75%和 50%乙醇中洗涤 3 min；最后在 PBS中洗涤 5 min。
   2. 抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫组化染色，并有必要进行抗原修复，可以使用适当的抗原修复液，或者自行配制的适当的抗原修复液进行抗原修复处理；

   注意：如果使用蛋白酶 K或胰酶进行抗原修复，必须反复洗涤干净，否则残留的酶会严重干扰后续标记反应。

   3. 转步骤 C。

C. EdU 检测

注意：在该步骤中，每孔使用 100 µL反应混合物。对于其它孔板或切片，反应混合物体积可根据实际情况进行调节，但必须按比例加入反应组分。

1. 根据下表制备 Click-iT反应混合物；

注意：要按表中列出的顺序添加成分，否则反应将无法得到最佳效果。配置好的 Click-iT反应混合物必须在 15 min内使用。

组分	体积
Deionized Water	758 µL
Reaction Buffer（10×）	100 µL
Copper Reagent	40 µL
AbFluor 488 Azide	2 µL
Reducing Agent（10×）	100 µL
Total Volume	1 mL

2. 向每个样品中加入 100 µL Click-iT反应混合物，室温下避光孵育 30 min；
3. 除去反应混合物，用 0.1 mL BSA Wash Solution (1×)浸洗孔中细胞 5 min，除去洗涤液；
4. 可选步骤：进行核染色（1×Hoechst 33342）或抗体标记；

重要提示：在孵育过程中一定要避光。如不需要其它染色，孵育后请直接进行成像和分析。

5. 用荧光显微镜（Ex/Em = 501/525 nm）分析样品中标记的 DNA，用 Ex/Em = 360/460 nm检测细胞核。

注意事项

1. 为避免交叉污染，在加入不同样本和不同试剂时都需更换吸头。
2. 实验开始前确保所有的组分及设备处于合适的温度。
3. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

草莓时刻：除了 DNA结构变化检测细胞增殖之外，多数情况下通过检测细胞质中的 NADH 的含量来评估细胞的增殖情况。DNA 的结构变化是细胞增殖的早期事件（KTA2030），而 DNA结构的变化导致 NADH的含量也随之发生改变（BMU106）。此外，要全面的检测细胞状态，还要从细胞凋亡（KTA2010、KTA0002）与细胞衰老（KTA3030）的角度进行分析。扫描右侧二维码，关注 Abbkine公众号，了解更多 Abbkine产品信息。

FAQ

1. Q: 该试剂盒是否可以染间充质干细胞，再进行活体移植？

   A: 建议先在体外培养观察染色效果，再进行移植实验，并在一周内进行显色和观察。

2. Q: 该试剂盒可以做组织染色吗？

   A: EdU适用于细胞增殖的检测，如客户想进行组织染色，建议用增殖抗体 PCNA（货号 ABP0112、A01040、ABP59848）及其直标抗体进行 IHC实验检测。

3. Q: 该试剂盒是否可以用免疫荧光（IF）一起双染？先后顺序是怎样的？

   A: 可以和 IF进行双染，建议先进行 EdU染色标记，再进行 IF染色。