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活动截止时间：2024年1月31日
CheKine™ 辅酶Ⅰ NAD(H) 含量检测试剂盒（微量法）是一款基于比色法的微量检测工具，专为定量分析细胞、细菌或组织提取物中NAD⁺/NADH浓度及其比值而设计。通过酶循环反应与WST-8显色体系，可在0.78–50 µM的线性范围内快速获得样本中氧化型NAD⁺与还原型NADH的精确数据，为细胞代谢研究提供可靠依据。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺/NADH）是细胞能量代谢的核心辅酶，在糖酵解、三羧酸循环及氧化磷酸化等氧化还原反应中充当电子载体，其氧化态（NAD⁺）与还原态（NADH）的动态平衡直接反映细胞代谢活性。此外，NAD⁺还参与ADP-核糖基化修饰及sirtuins介导的去乙酰化反应，调控基因表达与细胞应激响应。本试剂盒通过特异性酶循环反应放大信号，结合WST-8显色，实现微量样本中NAD⁺/NADH的高灵敏度检测。
适用于细胞代谢研究、肿瘤代谢重编程、线粒体功能评估、药物对能量代谢影响分析等场景，尤其适合体外培养的哺乳动物细胞、微生物及组织样本的NAD⁺/NADH动态监测。
| 中文名称 | 辅酶ⅠNAD(H)含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™ |
| 英文名称 | CheKine™ Micro Coenzyme Ⅰ NAD(H) Assay Kit |
| 产品货号 | KTB1020 |
| 检测类型 | 辅酶相关 |
| 检测方法 | 比色法 |
| 试剂盒组分 | • 实验缓冲液 • EtOH溶液 • WST-8溶液 • Enhancer增强剂 • NAD酶循环反应混合物 • NAD标准品 (11 mM) • NAD提取缓冲液 • NADH提取缓冲液 |
| 分子 | NAD(H） |
| 检测指标 | NAD(H） |
| 注意事项 | • 快速加入工作试剂应该很快，混合彻底。 •以下物质会干扰，应避免样品制备。 EDTA（> 0.5mM），抗坏血酸，SDS（> 0.2％），叠氮化钠，NP-40（> 1％）和吐温-20（> 1％）。 |
| 保存建议 | 建议收到货后避光保存于-20°C，有效期为6个月。请参考说明书中各个组分的最佳保存条件进行储存。 |
| 运输条件 | 冰袋运输（蓝冰） |
| 警告 | 本文列出的产品仅供研究使用，不适用于人类或临床诊断。我们产品所推荐应用，不是建议使用我们的产品去违反任何专利或许可证。对于使用本产品可能发生的专利侵权或其他违规行为，我们不承担任何责任。 |
Assay Buffer: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
EtOH Solution: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
WST-8: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。
Enhancer: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。
NAD Cycling Enzyme Mix: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。
NAD Standard: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装-20℃避光保存。
NAD Extraction Buffer: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
NADH Extraction Buffer: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
工作液配制：对于 96孔板，按照每孔配制 85 µL工作液，现配现用。吸取 68 µL Assay Buffer，1 µL NAD Cycling Enzyme Mix，5 µL WST-8，1 µL Enhancer混合后，室温孵育 5 min，再加入 10 µL EtOH Solution。
NAD标准曲线设置：把 5 µL 10 mM的 NAD用 995 µL Assay Buffer稀释至 1,000 µL 50 µM NAD预混物。按下表所示，进行下一步稀释：
| 序号 | 标准品体积（µL） | Assay Buffer (µL) | 浓度（µM） |
|---|---|---|---|
| Std.1 | 5 µL 10 mM NAD | 995 | 50 |
| Std.2 | 100 µL of Std.1 (50 µM) | 100 | 25 |
| Std.3 | 100 µL of Std.2 (25 µM) | 100 | 12.5 |
| Std.4 | 100 µL of Std.3 (12.5 µM) | 100 | 6.25 |
| Std.5 | 100 µL of Std.4 (6.25 µM) | 100 | 3.13 |
| Std.6 | 100 µL of Std.5 (3.13 µM) | 100 | 1.56 |
| Std.7 | 100 µL of Std.6 (1.56 µM) | 100 | 0.78 |
1. 组织样本的提取方法：冰上预冷的 PBS洗涤组织后，称取约 20 mg的组织样品，用剪刀剪碎，置于匀浆器中。
提取 NAD：加入 100 µL NAD Extraction Buffer匀浆样本。煮沸 5 min（盖紧，以防止水分散失）后加入 20 µL Assay Buffer和 100 µL NADH Extraction Buffer中和提取物。4℃，14,000 rpm离心 5 min，将上清转移到新离心管，冰上待测。
提取 NADH：加入 100 µL NADH Extraction Buffer匀浆样本。煮沸 5 min（盖紧，以防止水分散失）后加入 20 µL Assay Buffer和 100 µL NAD Extraction Buffer中和提取物。4℃，14,000 rpm离心 5 min。将上清转移到新离心管，冰上待测。
2. 细胞或细菌样本的提取方法：收集细胞或细菌样本（样本量建议为 1 x 106个/次），用冷 PBS清洗细胞或细菌，低速离心 5 min，弃上清液。
提取 NAD：加入 100 µL NAD Extraction Buffer，超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），煮沸 5 min（盖紧，以防止水分散失）后加入 20 µL Assay Buffer和 100 µL NADH Extraction Buffer中和提取物。4℃，14,000 rpm离心 5 min，将上清转移到新离心管，冰上待测。
提取 NADH：加入 100 µL NADH Extraction Buffer，超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），煮沸 5 min（盖紧，以防止水分散失）后加入 20 µL Assay Buffer和 100 µL NAD Extraction Buffer中和提取物。4℃，14,000 rpm离心 5 min。将上清转移到新离心管，冰上待测。
3. 血清（浆）样本的提取方法：
提取 NAD：吸取约 20 µL的血清（浆），加入 100 µL NAD Extraction Buffer，煮沸 5 min（盖紧，以防止水分散失）后加入 20 µL Assay Buffer和 100 µL NADH Extraction Buffer中和提取物。4℃，14,000 rpm离心 5 min，将上清转移到新离心管，冰上待测。
提取 NADH：吸取约 20 µL的血清（浆），加入 100 µL NADH Extraction Buffer，煮沸 5 min（盖紧，以防止水分散失）后加入 20 µL Assay Buffer和 100 µL NAD Extraction Buffer中和提取物。4℃，14,000 rpm离心 5 min。将上清转移到新离心管，冰上待测。
1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 450 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2. 在 96孔板或微量玻璃比色皿中，按照如下方式加样：
| 试剂 | 空白孔（μL） | 标准孔（μL） | 测定孔（μL） |
|---|---|---|---|
| Assay Buffer | 40 | 0 | 0 |
| 不同浓度标准品 | 0 | 40 | 0 |
| 样本 | 0 | 0 | 40 |
| 工作液 | 80 | 80 | 80 |
3. 充分混匀，室温孵育 30 min，测定 450 nm处的吸光值 A。计算ΔA 测=A 测-A 空，ΔA 标=A 标-A 空。
1. 标准曲线的绘制
以标准品浓度为 y轴，ΔA 标为 x轴，绘制标准曲线。将ΔA 测代入标准曲线来计算样本中 NAD/NADH的浓度 y。
2. 测定 NAD/NADH 含量的计算公式
1）按样本质量计算：
2）按样本蛋白浓度计算：
3）按细胞或细菌数量计算：
4）按血清（浆）计算：
nmol：1 μM=1 nmol/mL；V 样：加入样本体积，0.04 mL；V 样总：组织样本总体积，0.22 mL；V 提取：血清（浆）的体积，0.02 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；数量: 细胞或细菌数量，以 10⁴为单位；n：稀释倍数。
A: 这种情况是显色液很灵敏，反应过快造成的，此时0min的OD值不能反应样本中可能含有自带有色物质的吸光度。如果客户的样本是无色的话，就可以直接用20min的OD值进行计算，无需检测0min的吸光度。
A: NAD和NADH是分别提取出来，并分别检测的。
A: 按照比例配制成85ul体系工作液，只需要取其中的80ul进行下一步反应，多出的5ul是为了防止试剂损耗，可以舍弃。
A: n是稀释因子的意思。
A: Opposite Extraction Buffer是指反相提取液。因为该试剂盒是分别对NAD和NADH进行的检测。当提取NAD时，使用NAD提取液，随后用的反相提取液，即NADH提取液，用于中和多余的NAD提取液。
A: 动物研究，植物研究，微生物研究等相关单位都应用比较多。
A: 生化试剂盒已充分验证，适合于植物、动物和微生物等多种物种。 对于在植物、动物和微生物等不同材料之间确实存在很大差异的指标，尤其是酶活性测定指标，我们分别研发和生产了针对同一指标的不同类型试剂盒，并在试剂盒名称和代号上做了明确区分，请用户仔细核对，选择合适的试剂盒类型。如有疑问，请联系support@abbkine.com，进行深入探讨。
A: 不建议用，分光光度计每次检测的样本个数不超过4个，无法做到数据检测的同步。
A: 检测孔的数量=样本个数+标准品数×重复次数+预留补测数量，如有疑问，请联系support@abbkine.com，进行深入探讨。
A: 可以，用超声进行破碎微生物细胞，再进行细胞上清的检测，如有疑问，请联系support@abbkine.com，进行深入探讨。
杂志名称: INFLAMMATION RESEARCH | 作者: He S, Shi J, Liu W
IF: 7 | 发表时间: 2022
杂志名称: Biomolecules | 作者: Eleftheriadis T, Pissas G, Golfinopoulos S, et al.
IF: 6 | 发表时间: 2022
杂志名称: Oncotarget | 作者: Yang Y, Ren M, Song C, et al
IF: 4 | 发表时间: 2017
杂志名称: Adipocyte | 作者: S Liu, Y Li, X Fan
IF: 2 | 发表时间: 2020
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