NADH氧化酶(NOX)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 600 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 冷冻离心机、恒温箱
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

Sample Lysis Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。

Mitochondria Lysis Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Protease Inhibitor：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。

Chromogen：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Working Substrate：临用前配制；用前 Substrate加入 5 mL去离子水，实验时冰上放置。用不完的试剂-20℃避光分装保存 1个月，避免反复冻融。

样本制备

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1. 准确称取 0.1 g组织或收集 5×10⁶细胞或细菌，加入 1 mL Sample Lysis Buffer和 10 μL Protease Inhibitor，用匀浆器冰上匀浆。
2. 将匀浆液，600 g，4℃离心 5 min。
3. 将上清液移至另一离心管中，11,000 g，4℃离心 10 min。
4. 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 NOX（此步可选做）。第二次沉淀即为线粒体，加入 200 μL Mitochondria Lysis Buffer和 2 μL Protease Inhibitor，超声波破碎 5 min（功率 20%，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），用于 NOX活性测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 600 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2. Chromogen置于 25°C（一般物种）或者 37°C（哺乳动物）恒温箱中孵育 30 min。
3. 在 96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加样：

充分混匀，记录 600 nm处 10 s时吸光值 A1，迅速放入 25°C（一般物种）或者 37°C（哺乳动物）恒温箱中，准确反应 1 min。迅速取出记录 1 min 10 s时的吸光度 A2。

计算ΔA=A1-A2。记录ΔA 空白、ΔA 测定，ΔΔA=ΔA 测定-ΔA 空白。

结果计算

NOX活力单位的计算

A. 使用 96孔板测定的计算公式

1. 按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织在反应体系中每分钟 A600变化 0.005定义为一个酶活力单位。

2. 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 10⁴个细菌或细胞在反应体系中每分钟 A600变化 0.005定义为一个酶活力单位。

B. 使用微量玻璃比色皿测定的计算公式

1. 按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织在反应体系中每分钟 A600变化 0.01定义为一个酶活力单位。

2. 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 10⁴个细菌或细胞在反应体系中每分钟 A600变化 0.01定义为一个酶活力单位。

W：样本鲜重，g；T：反应时间，1 min；V 反总：反应体系总体积，0.25 mL；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 提取：加入提取液体积，1.01 mL；V 样总：沉淀重悬体积，0.202 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总数，5×10⁶。