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活动截止时间：2024年1月31日
亚科因生物研发的CheKine™ 辅酶Ⅱ NADP(H) 含量检测试剂盒（微量法）（CheKine™ Micro Coenzyme Ⅱ NADP(H) Assay Kit，货号：KTB1010）是一款基于比色法的微量检测工具，可在 96 孔板中快速、定量地测定细胞、组织提取物或细菌样本中 NADP⁺ 与 NADPH 的浓度及其比值，为细胞代谢与氧化还原状态研究提供可靠数据。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）是细胞内关键的氧化还原辅因子，以 NADP⁺（氧化型）和 NADPH（还原型）两种形式参与脂质合成、核酸合成及抗氧化防御等多种生物合成反应。磷酸戊糖途径（PPP）的氧化分支是动物细胞 NADPH 的主要来源，因此监测 NADP⁺/NADPH 水平对评估细胞能量转化与氧化还原稳态具有重要意义。本试剂盒利用 WST-8 显色体系，在 NADP 循环酶作用下，NADPH 将 WST-8 还原生成橙黄色甲臜产物，于 450 nm 处检测吸光度，吸光度与 NADP(H) 浓度呈线性关系，从而实现微量样本的高灵敏度定量。
本试剂盒适用于细胞代谢研究、肿瘤细胞能量代谢分析、细菌氧化应激模型、组织氧化损伤评估等方向，为探索 NADP(H) 在脂质合成、抗氧化防御及信号转导中的作用提供可靠工具。
| 中文名称 | 辅酶Ⅱ NADP(H)含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™ |
| 英文名称 | CheKine™ Micro Coenzyme Ⅱ NADP(H) Assay Kit |
| 产品货号 | KTB1010 |
| 检测类型 | 辅酶相关 |
| 检测方法 | 比色法 |
| 试剂盒组分 | • Assay Buffer • Glucose (1 M) • WST-8 Solution • Enhancer Solution • NADP Cycling Enzyme Mix • NADPH standard (10 mM) • NADP Extraction Buffer • NADPH Extraction Buffer |
| 分子 | NADP |
| 检测指标 | NADP |
| 注意事项 | • 快速加入工作试剂应该很快，混合彻底。 •以下物质会干扰，应避免样品制备。 EDTA（> 0.5mM），抗坏血酸，SDS（> 0.2％），叠氮化钠，NP-40（> 1％）和吐温-20（> 1％）。 |
| 保存建议 | 建议收到货后避光保存于-20°C，有效期为6个月。请参考说明书中各个组分的最佳保存条件进行储存。 |
| 运输条件 | 冰袋运输（蓝冰） |
| 警告 | 本文列出的产品仅供研究使用，不适用于人类或临床诊断。我们产品所推荐应用，不是建议使用我们的产品去违反任何专利或许可证。对于使用本产品可能发生的专利侵权或其他违规行为，我们不承担任何责任。 |
Assay Buffer: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
Glucose (1 M): 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
WST-8: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。
Enhancer: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。
NADP Cycling Enzyme Mix: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。
NADPH Standard: 临用前配制；加 1 mL的去离子水充分溶解，标准品的浓度是 10 mM。-20℃分装避光保存 1个月。
NADP Extraction Buffer: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
NADPH Extraction Buffer: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
工作液配置：每孔配制 85 µL工作液，现配现用。吸取 68 µL Assay Buffer，1 µL NADP Cycling Enzyme Mix，5 µL WST-8，1 µL Enhancer混合后，室温孵育 5 min，再加入 10 µL Glucose。
把 2 µL 10 mM的 NADPH用 998 µL Assay Buffer稀释至 1 mL 20 µM NADPH预混物。按下表所示，进行下一步稀释:
| 序号 | 20 µM NADPH预混物(µL) | Assay Buffer (µL) | Volume (µL) | NADPH (µM) |
|---|---|---|---|---|
| Std1. | 100 | 0 | 100 | 20 |
| Std2. | 50 | 50 | 100 | 10 |
| Std3. | 40 | 60 | 100 | 8 |
| Std4. | 20 | 80 | 100 | 4 |
| Std5. | 10 | 90 | 100 | 2 |
| Std6. | 5 | 95 | 100 | 1 |
| Std7. | 2.5 | 97.5 | 100 | 0.5 |
冰上预冷的 PBS洗涤组织后，称取约 20 mg的组织样品，用剪刀剪碎，置于匀浆器中。
提取 NADP：加入 100 µL NADP Extraction Buffer匀浆样本。煮沸 5 min（盖紧，以防止水分散失）后加入 20 µL Assay Buffer和 100 µL NADPH Extraction Buffer中和提取物。4℃，14,000 rpm离心 5 min。将上清转移到新离心管，冰上待测。
提取 NADPH：加入 100 µL NADPH Extraction Buffer匀浆样本。煮沸 5 min（盖紧，以防止水分散失）后加入 20 µL Assay Buffer和 100 µL NADP Extraction Buffer中和提取物。4℃，14,000 rpm离心 5 min。将上清转移到新离心管，冰上待测。
收集细胞或细菌样本（样本量建议为 1 x 106个/次），用冷 PBS清洗细胞或细菌，低速离心 5 min，弃上清液。
提取 NADP：加入 100 µL NADP Extraction Buffer，超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），煮沸 5 min（盖紧，以防止水分散失）后加入 20 µL Assay Buffer和 100 µL NADPH Extraction Buffer中和提取物。4℃，14,000 rpm离心 5 min，将上清转移到新离心管，冰上待测。
提取 NADPH：加入 100 µL NADPH Extraction Buffer，超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），煮沸 5 min（盖紧，以防止水分散失）后加入 20 µL Assay Buffer和 100 µL NADP Extraction Buffer中和提取物。4℃，14,000 rpm离心 5 min，将上清转移到新离心管，冰上待测。
提取 NADP：吸取约 20 µL的血清（浆），加入 100 µL NADP Extraction Buffer，煮沸 5 min（盖紧，以防止水分散失）后加入 20 µL Assay Buffer和 100 µL NADPH Extraction Buffer中和提取物。4℃，14,000 rpm离心 5 min，将上清转移到新离心管，冰上待测。
提取 NADPH：吸取约 20 µL的血清（浆），加入 100 µL NADPH Extraction Buffer，煮沸 5 min（盖紧，以防止水分散失）后加入 20 µL Assay Buffer和 100 µL NADP Extraction Buffer中和提取物。4℃，14,000 rpm离心 5 min。将上清转移到新离心管，冰上待测。
1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 450 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2. 在 96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加样：
| 试剂 | 空白孔（μL） | 标准孔（μL） | 测定孔（μL） |
|---|---|---|---|
| Assay Buffer | 40 | 0 | 0 |
| Stds. | 0 | 40 | 0 |
| 样本 | 0 | 0 | 40 |
| 工作液 | 80 | 80 | 80 |
3. 充分混匀，测定 450 nm处的吸光值 A1；室温孵育 30 min，再测定 450 nm处的吸光值 A2。计算ΔA=A2-A1，ΔΔA 标=ΔA 标-ΔA 空，ΔΔA 测=ΔA 测-ΔA 空。
以标准品浓度为 y轴，ΔΔA 标为 x轴，绘制标准曲线。将ΔΔA 测代入标准曲线来计算样本中 NADP/NADPH的浓度 y。
1）按样本质量计算：
NADP/NADPH (nmol/g) = 0.22×y÷W×n
（推导过程计算公式：(y×V 样)÷(W×V 样÷V 样总)×n）
2）按样本蛋白浓度计算：
NADP/NADPH (nmol/mg prot) = y÷Cpr×n
（推导过程计算公式：(y×V 样)÷(V 样×Cpr)×n）
3）按细菌或细胞数量计算：
NADP/NADPH (nmol/104) = 0.22×y÷数量×n
（推导过程计算公式：(y×V 样)÷(数量×V 样÷V 样总)×n）
4）按血清（浆）计算：
NADP/NADPH (nmol/mL) = 12×y×n
（推导过程计算公式：y×(V 样总+V 提取)÷V 提取×n）
nmol：1 μM=1 nmol/mL； V 样：加入样本体积，0.04 mL；V 样总：组织样本总体积，0.22 mL；V 提取：血清（浆）的体积，0.02 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；数量: 细胞或细菌数量，以 104为单位；n：稀释倍数。
A: 匀浆样本不是直接用枪头吹打混匀，而是用Dounce 均质器，或超声破碎，进行匀浆。
A: 样本中NADPH和NADP的含量的计算都可以通过这一个标准曲线进行计算。它们的浓度和吸光度关系是相同标准的。
A: 植物组织会变黄，动物样本一般不变黄。
A: 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3~5次。
A: 原理：NADP + / NADPH检测试剂盒基于葡萄糖脱氢酶循环反应，在这一反应过程中生成的NADPH将MTT还原生成formazan，在565nm左右检测有最大吸收峰。反应体系中生成的formazan与样品中总的NADP+或NADPH的总量呈正比关系。实验过程中需将样本平均分成两份，分别提取NADP和NADPH。
A: 建议60摄氏度水浴中进行反应，因为水的比热容比较大，易于让反应温度保持在60摄氏度，比较恒定。
A: 60℃水浴加热5分钟后，样品中未被提取的组分就会分解而只保留目标提取物。
A: 加样应迅速、麻利，工作液加热并混匀之后应迅速进行0 min检测，保证其为未反应时的数值。如有疑问，请联系support@abbkine.com进行详细咨询。
A: 这个实验不需要设置空白孔，0min的OD值可以做自身背景值的调零。所以不用设置空白孔。
A: 不存在，因为该试剂盒的样本前处理步骤中已经这两种物质分别进行了提取，再分别进行检测，所以不存在两种检测物之间的转化。
杂志名称: Molecules | 作者: Sun, Tong, et al.
IF: 4 | 发表时间: 2024
货号：KTB1310
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