NAD激酶(NADK)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 低温离心机、恒温箱、水浴锅
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Assay BufferⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Assay BufferⅡ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working ReagentⅠ的配制：使用前配制，在 Substrate Mix中加入 3 mL (48 T)/ 6 mL (96 T) Assay BufferⅠ，充分混匀待用。未使用的试剂分装后-20℃避光保存一周，避免反复冻融。

Working ReagentⅡ的配制：使用前配制，在 Enzyme Mix中加入 12.6 mL (48 T)/ 25.2 mL (96 T) Assay BufferⅡ，充分混匀待用。未使用的试剂分装后-20℃避光保存一周，避免反复冻融。

注意：Substrate Mix、Enzyme Mix在测定过程中都必须在冰上放置。测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）。

样本制备

1. 血浆和血清样本：可直接检测。
2. 组织样本：用冷的 PBS冲洗组织去除组织表面的血液。称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞和细菌样本：收集 500万细菌或细胞到离心管内，用冷 PBS清洗，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
4. 植物样本：用冷的 PBS冲洗植物样本去除表面的杂质。称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm，紫外分光光度计用去离子水调零。
2. 将 Assay BufferⅠ37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 15 min以上。
3. 设置测定管和对照管，按照如下方式加样（在 EP管中操作）：

充分混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 15 min，立即煮沸 2 min（盖紧，防止水分散失）冰浴冷却，10,000 g，室温离心 10 min。

4. 取各管中上清 40 μL加入 96孔 UV板或微量石英比色皿中，分别加入Working ReagentⅡ160 μL，迅速混匀。
5. 加完试剂混匀，室温静置 15 min，在 340 nm下测定吸光值，ΔA=A 测定-A 对照。

注意：每个样本均需要做对照管。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本的ΔA小于 0.01，可适当增大样本量，如果样本的ΔA大于 2.0，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，再进行实验，乘以最终的稀释倍数。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 用 96孔 UV板测定的计算公式如下

1. 血清（浆）NADK活性的计算

单位的定义：每 mL血清（浆）每分钟生成 1 nmol的 NADP定义为一个酶活力单位。

2. 组织、细菌或细胞中 NADK活性的计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g组织每分钟生成 1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADP定义为一个酶活力单位。

V 反总：反应体系总体积，1×10^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔 UV板光径，0.5 cm；10⁹：1 mol=10⁹ nmol；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1 mL；T：反应时间，15 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万个。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。