TAC总抗氧化能力检测试剂盒实验操作全流程：从样本制备到结果计算

适用产品： CheKine™ 总抗氧化能力（TAC）检测试剂盒（微量法），货号 KTB1500

适用读者： 首次使用TAC检测试剂盒的研究者；遇到异常结果需要排查的实验人员

TAC检测的操作流程并不复杂，但细节决定数据质量。说明书提供了标准步骤，本文在此基础上补充各样本类型的经验参数、常见失误的排查逻辑，以及结果归一化方式的选择依据——这些是说明书里有结论但没有展开原因的内容，也是实验室里靠口耳相传才能积累的经验。

一、实验前准备：容易被忽略的几件事

1.1 试剂平衡到室温，不要省这一步

底物（Substrate）和反应缓冲液（Reaction Buffer）平时保存在-20°C，使用前需充分平衡至室温。直接从冰箱取出就加样，低温会影响显色反应的速率和终点吸光度，导致结果系统性偏低。

平衡时间建议：小体积（≤500 μL）约15—20分钟，大体积（>1 mL）约30分钟，置于室温（20—25°C）即可，不需要加热。

1.2 工作液现配现用，不要提前配制

工作液由底物稀释液（Substrate Diluent）、底物（Substrate）、反应缓冲液（Reaction Buffer）按10:1:1比例混合而成。混合后的工作液在室温下稳定性下降较快，应在加样前15分钟内配制，当次用完，剩余部分丢弃。

提前数小时配好"备用"是常见失误，会导致空白孔背景升高、标准曲线线性变差。

1.3 酶标仪与酶标板

酶标仪需要预热30分钟以上，调节检测波长至593 nm，确认灯源稳定后再开始检测。检测中途更换孔板时不需要重新预热，但建议每次检测前用空白溶液验证仪器读数的稳定性。

酶标板使用普通透明96孔板即可，无需特殊材质。避免使用白色不透明板或黑色板——前者会产生光散射导致读数偏高，后者用于荧光检测，均不适合本比色体系。也无需使用蛋白低吸附板，FRAP体系中试剂与孔壁的非特异性吸附在标准透明板上可忽略不计。

1.4 Assay Buffer的配制

10× Assay Buffer用去离子水稀释至1×，临用前配制，4°C可保存2个月。注意使用去离子水而非蒸馏水或自来水——水中微量金属离子（尤其是铁离子）会干扰FRAP体系的本底值。

1.5 生物安全操作提示

实验全程请做好个人防护：穿戴实验服、手套和护目镜。处理人体血清或血浆样本时，应将其视为潜在生物危害品操作，避免直接接触皮肤和黏膜。试剂盒中的化学试剂具有一定刺激性，操作建议在通风橱或生物安全柜中进行。实验废液（含铁离子的显色废液、生物样本废液）不得直接倒入普通下水道，应按各单位的实验室废液分类处理规定回收处置。

样本制备质量是决定实验成败的最关键环节。以下按样本类型分别说明，重点补充说明书中未展开的经验细节。

2.1 动物组织

标准流程： 称取约0.1 g样本，加入1 mL 1× Assay Buffer，冰浴匀浆，10000 g、4°C离心10分钟，取上清待测。

经验补充：

• 称样量的弹性范围： 0.1 g是推荐起点，但不同组织的抗氧化物含量差异很大。富含抗氧化物的组织（如肝脏、脾脏）建议从0.05 g开始预实验；抗氧化物含量较低的组织（如肌肉、脂肪）可适当增加至0.15—0.2 g。
• 匀浆要彻底： 匀浆不充分是导致平行样本间差异大的常见原因。建议使用研磨珠匀浆仪或电动研磨棒，确保组织完全破碎，避免可见的组织块残留。全程保持冰浴，防止抗氧化物在匀浆过程中氧化降解。
• 离心后取上清要仔细： 避免吸取脂质层（样本表面的白色或黄色漂浮层）或沉淀，这两层都会引入干扰。吸管插入液面中层稳定吸取即可。
• 肝脏样本特别提示： 肝脏GSH含量极高，FRAP法单独检测会系统性低估TAC，建议同步检测GSH（KTB1600）。详见本系列原理科普文章。

2.2 植物组织

标准流程： 称取约0.1 g样本，加入1 mL 1× Assay Buffer，冰浴超声破碎5分钟（功率200 W，超声3秒/间隔7秒，重复30次），10000 g、4°C离心10分钟，取上清待测。

经验补充：

• 超声参数不要随意调整： 功率过高会导致样本升温，加速抗氧化物氧化；功率过低则破壁不完全，导致结果偏低。建议严格按200 W执行，若设备功率档位不精确，以"超声过程中液体温度不超过10°C"为判断标准。
• 含色素丰富的植物样本（如红叶、浆果）： 花青素、叶绿素等色素在593 nm附近有背景吸收，会导致空白校正不完全、结果偏高。建议在正式检测前测定样本提取液本身的593 nm吸光度，若背景值>0.1，需要适当稀释后再检测。
• 叶片样本去除叶脉： 叶脉组织密度高、破壁难度大，且与叶肉的抗氧化物含量差异显著。对叶片样本建议统一去除主叶脉，仅取叶肉部分，提高平行样本间的一致性。

2.3 细胞或细菌

标准流程： 收集5×10⁶个细胞或细菌，冷PBS清洗，800 g离心2分钟弃上清，加入1 mL 1× Assay Buffer，冰浴超声破碎5分钟（200 W，超声3秒/间隔7秒，重复30次），8000 g、4°C离心10分钟，取上清待测。

经验补充：

• 细胞数量的弹性： 5×10⁶是推荐起点。细胞类型不同，每个细胞内的抗氧化物含量差异很大。建议首次实验同时准备1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷三个梯度，根据ΔA落点确定后续实验的最佳细胞数。
• PBS清洗要彻底： 培养基中含有的抗氧化物质（如维生素C、β-巯基乙醇）会直接干扰FRAP检测。建议用冷PBS清洗至少2次，确保培养基残留降至最低。
• 超声破碎的冰浴控制： 细胞超声时升温更快，建议将EP管置于碎冰中，每超声1分钟停30秒散热，再继续，全程保持低温。
• 细胞裂解液含GSH的提示： 同动物组织中肝脏样本的说明，细胞裂解液中GSH贡献不可忽视，建议联合KTB1600检测。

2.4 血清、血浆及其他生物液体

标准流程： 直接取样检测，无需前处理。

经验补充：

• 血浆抗凝剂必须核查： 绝对禁止使用EDTA抗凝管采集的血浆——EDTA会与TPTZ竞争螯合铁离子，导致显色反应被完全抑制，得到假阴性结果。必须使用肝素锂或柠檬酸钠抗凝管，或直接使用血清。
• 血清的制备： 全血室温静置30—60分钟自然凝固后，2000—3000 g离心10—15分钟，取上层血清。避免溶血——溶血会释放红细胞内的抗氧化物质（尤其是GSH和抗坏血酸），导致TAC值虚高。
• 稀释建议： 血清和血浆通常不需要稀释即可直接检测，但如果首次使用某一物种（如大鼠、小鼠的血清），建议先做2×和4×稀释预实验，确认ΔA落在线性范围内。
• 尿液样本： 尿液中尿酸是TAC的主要贡献者，如果同步检测了血清尿酸水平，可以用KTB1510（尿酸检测）辅助解读TAC组分来源。

三、稀释预实验：正式检测前最重要的一步

无论使用哪种样本类型，正式检测前必须进行稀释预实验，而不是直接对所有样本上机检测。这是节省试剂和时间的最有效方式。

为什么要做预实验？

不同样本的抗氧化物含量可能相差数十倍甚至数百倍（例如，新鲜浆果提取液的TAC可能是血清的100倍以上）。如果不提前了解样本的大致读数范围，就无法知道应该以何种稀释倍数上机，导致大量样本超出线性范围需要返工。

预实验设计建议

从差异最大的2—3个样本开始，设置以下梯度：

目标是找到ΔA落在0.1—1.2之间的稀释倍数，在此范围内结果处于标准曲线的线性区间，计算结果最为可靠。

四、检测步骤：操作要点与易错节点

4.1 加样体系

每孔加样体积如下：

易错点：

• 空白孔和阳性孔通常各做1个即可，不需要做多复孔，因为它们的作用是校正背景和验证试剂状态，而非统计分析对象。样本孔才需要做2—3个复孔。
• 加样顺序建议：先加工作液，再加样本/去离子水/阳性对照。这样可以避免样本在孔底干燥，也便于混匀。
• 多样本操作时建议使用多通道移液器，减少孔间加样时间差异，提高批内一致性。

4.2 混匀与孵育

加样完成后，立即在酶标仪振荡或用封板膜覆盖后手动轻振混匀，室温反应5分钟，随后立即读板。

注意事项：

• 5分钟是反应终点时间，不要随意延长孵育时间。反应在此时间点达到最大吸光度，之后可能因底物消耗或非特异性反应出现缓慢漂移。
• 混匀要充分，但避免剧烈振荡产生气泡——气泡会导致局部光路异常，影响个别孔的读数。若出现气泡，用枪头轻轻戳破后再读板。
• 反应对温度有一定敏感性，建议整个检测过程在室温（20—25°C）相对稳定的环境中进行，避免空调直吹或阳光直射孔板。

4.3 吸光度读取

酶标仪在593 nm处读取吸光度，分别记录A空白、A测定、A阳性，随后计算：

• ΔA测定 = A测定 − A空白
• ΔA阳性 = A阳性 − A空白

ΔA阳性是每次实验的内部质控指标。如果阳性对照的吸光度与历史值相比偏低超过20%，通常提示试剂活性下降（最常见原因：工作液提前配制、底物反复冻融次数过多），建议检查试剂状态后重做。

五、结果计算：归一化方式的选择逻辑

KTB1500提供了4种归一化方式，但说明书没有说明各方式的适用场景。以下给出选择建议。

公式中各变量含义统一说明：

• y：将ΔA测定值代入标准曲线公式（y = 4.4664x + 0.0685）后计算得到的Fe²⁺终浓度，单位 μmol/mL
• W：样本鲜重，单位 g
• Cpr：样本裂解液的蛋白浓度，单位 mg/mL（由BCA法等蛋白定量方法测定）
• V反总：反应总体积，固定为0.19 mL
• V样：加入反应体系中的样本体积，固定为0.01 mL

标准曲线质控建议： 标准曲线应使用线性回归拟合，R²应≥0.99方可用于计算。若R²<0.99，需检查标准品配制是否准确、工作液是否新鲜，排查后重新制作标准曲线。KTB1500试剂盒预设标准曲线公式为 y = 4.4664x + 0.0685（R² = 0.9986），可直接用于结果计算；若实验室条件与预设条件存在差异，建议自行验证标准曲线。

5.1 按样本质量计算（μmol/g）

TAC (μmol/g) = 19 × y ÷ W

适用场景： 组织样本的初步分析，或不同实验室之间的数据快速比较。

局限： 不同组织的含水量和细胞密度差异大，按质量归一化的结果在跨组织类型比较时意义有限。例如，脂肪组织含水量远低于肌肉组织，同等质量样本中的细胞数量差异极大。

5.2 按蛋白浓度计算（μmol/mg）

TAC (μmol/mg) = 19 × y ÷ Cpr

适用场景： 细胞样本、多种组织类型的横向比较、发表文章的首选归一化方式。

推荐理由： 蛋白浓度是细胞"生物量"最常用的参考基准，以蛋白归一化的TAC数据在组织间、处理组间的可比性最强，也是大多数期刊审稿人的预期格式。建议与BCA法蛋白定量试剂盒（如KTD3001）联用。

操作要点： 用于蛋白定量的样本应与用于TAC检测的样本来自同一裂解液批次，避免因不同批次制备引入的系统误差。

5.3 按细胞/细菌数量计算（μmol/10⁴）

TAC (μmol/10⁴) = 0.038 × y

适用场景： 细胞系实验，尤其是细胞状态（增殖速率、密度）相对均一的体外实验。

局限： 如果不同处理组的细胞大小或代谢状态差异较大（例如，处理组细胞明显萎缩），按细胞数归一化可能掩盖这种差异；此时按蛋白归一化更能反映真实情况。

5.4 按液体体积计算（μmol/mL）

TAC (μmol/mL) = 19 × y

适用场景： 血清、血浆、尿液、食品提取液等液体样本；植物提取物的初步筛选。

注意： 血清TAC数据解读时需考虑尿酸的主导效应（详见原理科普文章），避免将高TAC值直接等同于强抗氧化保护能力。

六、结果异常排查：ΔA过高或过低怎么办？

说明书只给了一条处理建议："ΔA>1.5，稀释样本重测"。实际实验中遇到的异常情况更多，以下是系统性排查思路。

6.1 ΔA测定过高（>1.5）

最常见原因及处理方法：

6.2 ΔA测定过低（接近0或为负值）

这种情况比ΔA过高更需要警惕，因为它往往不是样本本身的问题，而是试剂或操作出现了问题：

6.3 平行复孔间差异过大（CV>15%）

七、批间一致性控制：多批次实验的质控建议

如果课题需要跨批次检测（例如，分多次收集样本，分批上机），以下措施有助于保证数据的批间可比性：

• 每批次必须设阳性对照： Working Ascorbic Acid阳性孔不只是验证试剂活性，更是跨批次数据比对的锚点。建议记录每批次的ΔA阳性值，如果同一配制浓度下不同批次的ΔA阳性偏差超过10%，需要查明原因后再比较批间数据。
• 建立批次记录表： 记录每批次的检测日期、底物批号、ΔA空白均值、ΔA阳性值，便于事后溯源。
• 同批次检测同一实验组： 尽量确保同一对比组（如对照组与处理组）的样本在同一批次内完成检测，避免批间差异混入组间差异。
• 样本分装冻存： 如果样本需要等待批次凑够再检测，应在制备后立即按单次用量分装至-80°C保存，避免反复冻融。

推荐产品

CheKine™ 总抗氧化能力（TAC）检测试剂盒（微量法）货号：KTB1500 | 规格：96T / 480T

本文涉及的联合检测产品：

本文内容仅供科学研究参考，产品用途为科学研究使用，不适用于临床诊断。