小鼠肝脏TG甘油三酯含量检测完整实验方案（附排错指南）
前言：为什么肝脏TG检测比血清更容易出问题？
血清TG检测相对简单——样本直接加入反应体系即可。但肝脏组织TG检测涉及取材、称重、匀浆、抽提、离心等多个前处理步骤，每一步都可能引入误差，任何一步出问题，最终数据都无法挽救。
本文以小鼠肝脏组织为样本，提供一份从取材到出数据的完整操作流程，包括每步的关键参数、预期现象、常见失误和排错思路。适合脂肪肝（MASLD/NAFLD）、肥胖、糖尿病等代谢相关研究方向使用。
一、实验前准备清单
1.1 仪器与耗材
| 仪器/耗材 | 规格要求 | 备注 |
|---|---|---|
| 酶标仪 | 可检测505 nm | 实验前预热≥30 min |
| 96孔酶标板 | 普通透明平底板 | 非透明板会影响读数 |
| 低温离心机 | 可达8000 g，4℃ | 提前预冷至4℃ |
| 匀浆器 | 组织研磨仪或手动匀浆管 | 玻璃匀浆管效果更均一 |
| 可调移液枪 | 10 μL、200 μL、1 mL量程 | 枪头提前在冰上预冷 |
| 多通道移液器 | 8通道或12通道 | 样本量大时提高效率 |
| 冰盒 | — | 全程保持样本低温 |
| 1.5 mL离心管 | 低吸附型（可选） | 普通EP管亦可 |
| 分析天平 | 精度≥0.1 mg | 称量组织用 |
1.2 试剂准备
前一天：
- 将4℃保存的Extraction Buffer、Reagent III、Standard取出确认无变质
- 检查Reagent I（-20℃）和Reagent II（4℃）粉末状态，确认无结块、变色
实验当天（上机前30–60 min）：
| 试剂 | 准备操作 | 注意事项 |
|---|---|---|
| Extraction Buffer | 平衡至室温 | 4℃保存，即用型 |
| Reagent III | 平衡至室温 | 用于溶解Reagent I和II |
| Standard（1.25 mg/mL） | 平衡至室温 | 避光，勿涡旋，轻柔混匀 |
| Working Reagent I | 临用前：48T加6 mL Reagent III充分溶解 | 避光，配好后立即使用 |
| Working Reagent II | 临用前：48T加6 mL Reagent III充分溶解 | 避光，配好后立即使用 |
| Working Solution | 临用前：Working Reagent I和II按1:1混合 | 现配现用，配好后30 min内用完 |
⚠️ 关键提示： Working Solution是整个检测体系最敏感的试剂，配制完成后每过30分钟酶活性下降约5–8%。如果样本数量较多（>48个），建议分批配制Working Solution，每批覆盖约30–40孔的用量。
二、样本制备——最容易出误差的阶段
2.1 取材前：禁食状态的统一标准（说明书没写但至关重要）
这是文献中最常被忽略、也是造成批次间数据大幅波动的首要原因。
禁食状态对肝脏TG的影响：
小鼠取材前是否禁食，对肝脏TG水平有决定性影响。进食状态下，门静脉携带大量膳食来源的脂肪酸进入肝脏，肝脏TG合成和储存处于活跃状态；禁食状态下，肝脏从脂肪组织动员的游离脂肪酸中重新酯化TG，两种状态下肝脏TG水平可相差20–40%，在脂肪肝模型中差异更大。
如果你的实验中一部分动物取材前刚好进食，另一部分空腹了数小时，这个差异会直接叠加到组间比较中，与处理效应混淆，结果无法解释。
推荐标准：
| 实验目的 | 建议禁食方案 |
|---|---|
| 评估基础肝脏脂质储存（常规脂肪肝模型） | 取材前禁食4–6小时（白天进行，避开夜间活跃期） |
| 评估禁食诱导的脂质动员 | 取材前禁食16–18小时（过夜禁食） |
| 评估餐后脂质代谢 | 统一随意进食，并记录最后一次进食时间 |
⚠️ 执行要求： 同一实验批次内所有动物的禁食时间必须一致，误差控制在**±30 min**以内。处死顺序建议按组别交替进行（对照组1只→实验组1只→对照组1只……），避免因时间差异导致的系统性偏差。禁食方案必须写入Materials & Methods，审稿人会核查。
2.2 取材与称重
处死小鼠后立即取肝脏，预冷PBS冲洗残余血液，吸水纸吸干。取肝脏同一解剖位置（推荐左叶中段），不同叶的TG含量存在解剖学差异，跨叶取样会引入额外变异。称取约0.1 g（精确到0.1 mg），记录实际质量W，立即置于冰上EP管。
取材到加入Extraction Buffer的时间控制在15 min以内——超过这个时间，内源性脂酶在细胞破裂后开始活化，TG会发生原位水解，导致结果系统性偏低。
预期外观： 正常C57BL/6小鼠肝脏深红褐色，质地均匀；HFD模型肝脏黄色或黄白色，质地偏软、油腻感明显；MCD/ob/ob模型肝脏可见明显的黄白色斑块，体积通常偏大。外观可作为模型建立成功的初步判断，但不能替代TG定量。
2.3 提取方法的选择：商用提取法 vs Folch/Bligh-Dyer法
这是说明书完全不会告诉你的内容，但在方法学选择上至关重要。
商用试剂盒的单相提取法（本文采用）：
使用含有机溶剂的单相Extraction Buffer，操作简便，与后续酶法反应体系直接兼容，适合大通量样本。对于大多数常规模型（正常小鼠、HFD 8–12周、轻中度脂肪肝），提取效率足够。
局限性： 在重度脂肪肝模型（MCD饮食、ob/ob、重度NASH）中，肝脏TG含量极高，脂滴大量聚集，单相提取可能存在提取不完全的问题——部分TG仍包裹在未充分破碎的脂滴中，导致检测结果系统性偏低。
经典双相提取法（Folch法 / Bligh-Dyer法）：
使用氯仿/甲醇体系进行两相萃取，是脂质提取的金标准方法，提取率更高、特异性更强，在代谢领域高分文章（尤其是脂质组学相关研究）中仍是首选。
但其缺点也很明显：氯仿有毒需要通风柜操作，步骤繁琐（有机相分离→蒸干→重溶）耗时较长，且提取产物需要重溶后才能与酶法检测体系兼容，额外增加了操作步骤。
实际选择建议：
| 样本情况 | 推荐方法 |
|---|---|
| 正常小鼠、HFD ≤12周、轻中度脂肪肝 | 商用Extraction Buffer（简便，效率足够） |
| 重度脂肪肝（MCD、ob/ob、严重NASH） | 建议Folch法提取后重溶，或同时设置两种方法做方法学对照 |
| 投稿高分期刊需要方法学严谨性 | 在补充材料中说明选用方法的依据，或提供与Folch法的比较数据 |
如果你的实验使用商用提取法，在Materials & Methods中应明确说明提取体系类型，而不仅仅写"商用试剂盒（货号XXX）"——部分审稿人会追问提取效率验证。
2.4 匀浆与抽提
向组织中加入1 mL Extraction Buffer（室温），冰浴匀浆至无明显组织块。
匀浆方式的选择——这里有一个说明书没有明确的判断：
手动匀浆（研磨30–60 s）对正常肝脏组织通常足够。但高脂模型肝脏的质地松软、脂滴丰富，脂质容易包裹在细胞碎片中，仅靠机械研磨不能保证充分释放。
推荐处理方式（按模型严重程度）：
| 样本类型 | 推荐匀浆方式 |
|---|---|
| 正常小鼠肝脏 | 手动冰浴匀浆30–60 s |
| HFD ≤12周模型 | 手动匀浆60 s，或增加超声破碎1–2次（200W，超声3 s/间隔7 s，重复5次） |
| 重度脂肪肝模型 | 超声破碎（200W，超声3 s/间隔7 s，重复10–15次），全程冰浴，避免升温 |
超声破碎能有效打破脂滴-蛋白质复合结构，显著提高重度脂肪肝样本的TG提取效率。超声功率不宜过高，全程冰浴避免温度升高导致脂质氧化。
匀浆完成后静置5 min，8000 g，4℃，离心10 min，取上清置冰上待测。上清应在2小时内完成检测。
自查： 取1 μL上清在白色背景纸上，液滴均匀无颗粒为合格；有明显颗粒说明匀浆不充分，需延长处理时间。
2.3 蛋白定量样本的并行制备（蛋白归一化必须步骤）
如需将TG结果按蛋白浓度归一化（推荐用于投稿高分期刊），必须单独制备蛋白定量样本，不能使用TG提取上清。
操作： 另取约0.05 g同一样本（或从同一动物的相邻位置取样），加入0.5 mL去离子水或PBS，冰浴匀浆，8000 g，4℃，离心10 min，取上清用BCA法测定蛋白浓度。
为什么不能用TG提取上清做BCA？ Extraction Buffer含异丙醇，会使蛋白变性沉淀，BCA测出的蛋白浓度会严重偏低（通常<10%真实值），导致归一化后TG数值虚高。
三、检测体系配制与上机
3.1 样本稀释预判
在正式上机前，根据样本类型预判是否需要稀释：
| 样本情况 | 建议处理 |
|---|---|
| 正常小鼠肝脏 | 通常无需稀释，直接检测 |
| 高脂饮食模型（HFD 8周以上） | 建议先稀释2–5倍预测信号范围 |
| NASH/重度脂肪肝模型 | 建议稀释5–10倍 |
| 预实验ΔA > 1.0 | 用Extraction Buffer适当稀释，n相应增大 |
| 预实验ΔA < 0.01 | 增加样本投料量或减少Extraction Buffer体积 |
⚠️ 强烈建议： 第一次使用新批次样本时，选2–3个预期差异较大的代表性样本做预实验，确认信号范围后再正式检测全部样本。
3.2 96孔板布局
推荐的孔板布局（以24个样本为例，每样本双复孔）：
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A [空白] [标准] [S1] [S1] [S2] [S2] [S3] [S3] [S4] [S4] [S5] [S5] B [S6] [S6] [S7] [S7] [S8] [S8] [S9] [S9] [S10][S10][S11][S11] C [S12][S12][S13][S13][S14][S14][S15][S15][S16][S16][S17][S17] D [S18][S18][S19][S19][S20][S20][S21][S21][S22][S22][S23][S23] E [S24][S24][ — ][ — ]...
说明：
- 空白孔和标准孔通常各做1个，如样本数量多可各做2个取平均值
- 每个样本至少做双复孔，计算时取平均ΔA
- 同一实验批次的所有样本尽量在同一块96孔板上完成，避免跨板误差
3.3 加样操作（单孔体积200 μL）
按以下顺序和体积加样：
| 试剂 | 空白孔 | 标准孔 | 测定孔 |
|---|---|---|---|
| 样本上清 | 0 μL | 0 μL | 10 μL |
| Extraction Buffer | 10 μL | 0 μL | 0 μL |
| Standard | 0 μL | 10 μL | 0 μL |
| Working Solution | 190 μL | 190 μL | 190 μL |
加样顺序建议： 先加样本/标准品/Extraction Buffer，最后加Working Solution，加完后立即用封板膜覆盖（如没有封板膜可用铝箔遮光），轻拍板底混匀，不要涡旋。
3.4 孵育与读板
- 室温（20–25℃）静置20 min，期间避光
- 孵育结束后立即上机，在505 nm处读取吸光度
- 读板应在5 min内完成，避免颜色持续变化影响数值
预期吸光度范围（参考值）：
| 孔类型 | 预期A505范围 |
|---|---|
| 空白孔 | 0.03–0.08 |
| 标准孔（1.25 mg/mL） | 0.25–0.45 |
| 正常小鼠肝脏测定孔 | 0.15–0.35 |
| 脂肪肝模型测定孔 | 0.35–0.80（视模型严重程度） |
四、结果计算
4.1 基础公式
ΔA标准 = A标准 - A空白 ΔA测定 = A测定 - A空白
按样本鲜重计算（最常用）：
TG (mg/g) = 1.25 × ΔA测定 ÷ ΔA标准 ÷ W × n
其中：W = 样本鲜重（g），n = 稀释倍数（不稀释时n=1）
实际计算示例：
取0.102 g肝脏，加1 mL Extraction Buffer，未稀释直接检测。 A空白 = 0.052，A标准 = 0.318，A测定 = 0.476
ΔA标准 = 0.318 - 0.052 = 0.266 ΔA测定 = 0.476 - 0.052 = 0.424
TG (mg/g) = 1.25 × 0.424 ÷ 0.266 ÷ 0.102 × 1 = 19.47 mg/g
按蛋白归一化计算（高分期刊推荐）：
TG (nmol/mg prot) = 1.25 × ΔA测定 ÷ ΔA标准 ÷ Cpr × n
其中 Cpr = 用去离子水提取后BCA测定的蛋白浓度（mg/mL）
4.2 参考区间
以下为文献中常见的小鼠肝脏TG参考范围（仅作相对参考，实际值因品系、性别、日龄、饲料不同存在较大差异）：
| 模型 | 肝脏TG参考范围（mg/g鲜重） |
|---|---|
| 正常C57BL/6小鼠（普通饲料） | 5–15 mg/g |
| 高脂饮食（HFD，60% kcal fat，8周） | 30–80 mg/g |
| MCD饮食（蛋氨酸胆碱缺乏模型） | 60–150 mg/g |
| ob/ob基因敲除小鼠 | 80–200 mg/g |
五、排错指南
5.1 信号异常的系统性排查
问题1：ΔA测定 < 0.01，信号几乎为零
| 可能原因 | 排查方法 | 解决方案 |
|---|---|---|
| Working Solution配制失败（粉末未充分溶解） | 观察Working Solution是否澄清 | 重新配制，充分振荡溶解后静置5 min再用 |
| Reagent I酶活性失活 | 用新批次或其他保存条件良好的Reagent I重测 | 检查-20℃保存记录，是否有反复冻融 |
| 样本量太少/TG含量本身极低 | 增加样本投料量至20 μL（同时减少Extraction Buffer至0 μL） | 增大取样量或延长提取时间 |
| 匀浆不充分，TG未被提取 | 观察上清是否澄清 | 延长匀浆时间，或增加超声破碎步骤 |
问题2：ΔA测定 > 1.0，信号饱和
| 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|
| 样本TG含量过高（重度脂肪肝） | 用Extraction Buffer稀释样本2–10倍，n相应增大 |
| 孵育时间过长 | 严格控制20 min，读板时间固定 |
问题3：复孔之间误差 > 15%
| 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|
| 加样体积不准 | 校准移液枪，使用多通道移液器 |
| Working Solution分布不均 | 加入Working Solution后充分混匀再读板 |
| 样本匀浆不均一 | 匀浆后涡旋混匀，再取样 |
| 孔边效应 | 避免使用96孔板最外圈一排（蒸发不均匀） |
问题4：空白孔吸光度偏高（A空白 > 0.15）
| 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|
| 试剂被光照污染 | 检查操作过程是否全程避光，重新配制试剂 |
| Reagent I或II已降解 | 检查保存条件，更换新试剂 |
| 酶标板本身有荧光本底 | 更换品牌或批次的酶标板，建议使用光学级透明板 |
问题5：不同批次样本数据无法横向比较
这通常不是操作失误，而是实验设计问题——每次检测都应在同一板上设置空白孔和标准孔，不能用A批次的ΔA标准套用到B批次的计算中。如需跨批次比较，建议每次检测时纳入一个固定的"内部对照样本"（如同一批次正常小鼠肝脏匀浆分装保存在-80℃），用于评估批次间的系统误差。
六、游离甘油干扰的处理（脂肪肝研究必读）
小鼠肝脏，尤其是脂肪肝模型的肝脏，游离甘油含量可能显著升高。如果你的实验中包含促脂解干预（如禁食处理、β肾上腺素受体激动剂、脂联素处理等），必须考虑游离甘油干扰。
操作方案： 在标准测定孔之外，每个样本额外设置一个"游离甘油对照孔"——体系完全相同，但Working Solution中不含脂蛋白酯酶（LPL）（如果你的试剂盒不支持单独去除LPL，可联系厂商技术支持确认操作方式）。
真实TG信号 = ΔA总测定 - ΔA游离甘油对照 真实TG含量 = 1.25 × (ΔA总测定 - ΔA游离甘油对照) ÷ ΔA标准 ÷ W × n
七、完整实验时间安排（单次实验，24个样本）
| 时间段 | 操作内容 | 耗时 |
|---|---|---|
| D-1晚 | 检查试剂存量，确认酶标仪预约 | 15 min |
| 实验当天 T+0 | 取出Extraction Buffer、Standard、Reagent III平衡室温；酶标仪开机预热 | 30 min |
| T+30 min | 取材、称重、加Extraction Buffer匀浆 | 60 min |
| T+90 min | 8000 g离心10 min；同步配制Working Reagent I和II | 15 min |
| T+105 min | 吸取上清；配制Working Solution（1:1混合） | 10 min |
| T+115 min | 96孔板加样（样本+标准品+空白） | 15 min |
| T+130 min | 加Working Solution，混匀，避光室温孵育20 min | 20 min |
| T+150 min | 505 nm读板，5 min内完成 | 5 min |
| T+155 min | 数据导出，计算TG含量 | 30 min |
| 总计 | 约3.5小时 |
总结
小鼠肝脏TG检测的核心风险点集中在三个环节：取材后的快速处理（避免原位脂解）、匀浆质量（影响抽提效率）、Working Solution的时效控制（影响酶活性）。排错时按"信号异常→试剂→操作→样本"的顺序逐步排查，大多数问题都可以在重复实验前找到根本原因。
推荐使用 CheKine™ 甘油三酯（TG）检测试剂盒（微量法，KTB2200） 进行上述实验，该试剂盒说明书中包含各类样本的详细操作参数，并提供在线计算器辅助结果计算。已被多项脂肪肝和代谢综合征相关研究引用，方法学经同行验证。
技术咨询：400-6800-830
