肝脂酶(HL)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 595 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、制冰机、离心机
• 去离子水、丙酮
• 研钵或匀浆器

试剂准备

• Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。
• Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。
• Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温，若有沉淀析出属正常现象，室温静置至沉淀消失即可（期间请勿大力摇晃）。4℃保存。
• Reagent IV：临用前配制；48 T加入 0.7 mL去离子水，96 T加入 1.4 mL去离子水，吹打至充分溶解，用不完的试剂-20℃分装避光可以保存 2周，避免反复冻融。
• Standard：临用前配制；加入 1 mL丙酮配制成 10 µmol/mL的α-萘酚标准溶液，用不完的试剂-20℃避光可以保存 2周。

注意：Reagent II 有毒，Standard有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

标准品制备：吸取 30 μL 10 µmol/mL的α-萘酚标准溶液于 EP管中，向其中加入 930 μL Reagent I 配制成 0.3125 µmol/mL的α-萘酚标准品，现用现配。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Reagent I，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 血清（浆）等液体样本：直接测定。若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min，调节波长到 595 nm。可见分光光度计用去离子水调零。
2. 将 Reagent III在 30℃预热 20 min以上。

操作表（下述操作在 96孔板或微量玻璃比色皿中进行）

充分混匀，30℃静置 5 min后，于 595 nm处测定吸光值，分别记为 A 测定、A 对照、A 标准、A 空白，计算ΔA 测定=A 测定-A 对照、ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：每个测定管孔设一个对照孔，标准曲线和空白孔只用测 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测定小于 0.05可适当加大样本量。如果ΔA 测定大于 0.7，样本可用去 Reagent I 进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

HL活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每mg蛋白每分钟水解α-乙酸萘酯产生 1 µmol的α-萘酚为一个酶活力单位。

（2）按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每 g组织每分钟水解α-乙酸萘酯产生 1 µmol的α-萘酚为一个酶活力单位。

（3）按样本体积计算：

酶活单位定义：每mL血清每分钟水解α-乙酸萘酯产生 1 µmol的α-萘酚为一个酶活力单位。

C 标准：α-萘酚标准品浓度，0.3125 μmol/mL；V 样：反应体系中加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入 Reagent I 总体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，10 min；W：样品质量，g；F：样本稀释倍数。

注意事项

1. Reagent III 出现气泡可静置，待气泡消失，加样时不要吸到气泡。
2. Reagent IV 可能会析出少量沉淀，吹打使其充分溶解。
3. 若样本为动物肝脏，建议将样本用 Reagent I 稀释 25倍以上再进行检测，并在计算公式中乘以稀释倍数。
4. 若样本为肥胖型动物血清或血浆，建议将样本用 Reagent I 稀释 5倍以上再进行检测，并在计算公式中乘以稀释倍数。