脂肪酶(LPS)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 710 nm处的吸光度）
• 96孔板（非聚苯乙烯材质）或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温箱、震荡混匀器、制冰机、低温离心机
• 去离子水、甲苯
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

• Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温，用震荡混匀器剧烈震荡 20 min；4℃避光保存。
• Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
• Standard：临用前配制；加入 3.168 mL甲苯，充分溶解即为 10 µmol/mL的油酸标准溶液；用不完的试剂可以 4℃保存一个月。

注意：Reagent II、Reagent III 和 Standard有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 动植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Reagent I，冰浴匀浆，12,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞：收集 1,000万细胞到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Reagent I，冰浴超声波破碎细胞 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 12,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）等液体样本：直接检测

注意：1. 高脂样本离心后若上清液之上有固态脂类，需用棉签等擦除后测定。
2. 如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min，调节波长到 710 nm。可见光分光光度计用去离子水调零。
2. Reagent I 和 Reagent II 置于 37℃水浴中预热 30 min以上。

操作表（下述操作在 1.5 mL EP管中进行）

注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA 测定小于 0.01可适当加大样本量，如果ΔA 测定大于 1.0，样本可用 Reagent I 进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟水解橄榄油生成 1 μmol脂肪酸为一个酶活单位。

LPS (U/mg prot)=16×ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr

2. 按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟水解橄榄油生成 1 μmol脂肪酸为一个酶活单位。

LPS (U/g 鲜重)=16×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W

3. 按照细胞数量计算

活性单位定义：37℃中每 104个细胞每分钟水解橄榄油生成 1 μmol脂肪酸为一个酶活单位。

LPS (U/104cell)=16×ΔA 测定÷ΔA 标准÷N

4. 按照液体体积计算

活性单位定义：37℃中每毫升血清每分钟水解橄榄油生成 1 μmol脂肪酸为一个酶活单位。

LPS (U/mL)=16×ΔA 测定÷ΔA 标准

其中：
C 标准：标准品的浓度，10 µmol/mL；
V 反总：反应总体积，0.8 mL；
V 样：反应中加入样本体积，0.05 mL；
V 样总：加入 Reagent I 体积，1 mL；
Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；
W：样本质量，g；
N：细胞数量，104；
T：催化反应时间，10 min。

注意事项

1. 甲苯有毒，实验过程中需佩戴手套和口罩，建议在通风橱中操作。
2. 实验过程中须远离火源。