脂肪酸合成酶(FAS)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 制冰机、低温离心机、水浴锅
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

试剂盒组分

Extraction Buffer：即用型；用前一天取出置于 4℃充分解冻后混匀，平衡到室温；-20℃保存。

Assay Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working NADPH：临用前 96 T加入 1.968 mL Assay Buffer，48 T加入 0.984 mL Assay Buffer，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存 2周，禁止反复冻融。

Working Acetyl CoA：临用前 96 T加入 0.528 mL Assay Buffer，48 T加入 0.264 mL Assay Buffer，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存 2周，禁止反复冻融。

Working Malonyl CoA：临用前 96 T加入 1.008 mL Assay Buffer，48 T加入 0.504 mL Assay Buffer，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存 2周，禁止反复冻融。

工作液的配制：每孔配制 180 µL工作液：吸取 16 µL Working NADPH，4 µL Working Acetyl CoA，8 µL Working Malonyl CoA和 152 µL Assay Buffer。工作液需现配现用，根据需要测定的样本数按比例配制。

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，12,000 g，4℃离心 40 min，取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer捣碎，冰浴超声波破碎细胞 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），12,000 g，4℃离心 40 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞或细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），12,000 g，4℃离心 40 min，取上清液，置冰上待测。
4. 血清（浆）等液体样本：直接测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。
2. 恒温箱预热到 37℃，工作液置于恒温箱中预热 15 min以上。
3. 在 96孔 UV板或微量石英比色皿中依次加入 20 μL样本和 180 μL工作液，迅速混匀，测定 340 nm处吸光值。记录第 10 s和 70 s时吸光值，分别记录为 A1和 A2。ΔA 测=A1-A2。

结果计算

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式

1. 按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每 mg蛋白每分钟氧化 1 nmol NADPH为 1个酶活单位。

2. 按照样本质量计算

活性单位定义：每 g组织每分钟氧化 1 nmol NADPH为 1个酶活单位。

3. 按细胞或细菌数量计算

活性单位定义：每 10⁴个细胞或细菌每分钟氧化 1 nmol NADPH为 1个酶活单位。

4. 按液体体积计算

活性单位定义：每 mL样本每分钟氧化 1 nmol NADPH为 1个酶活单位。

ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96孔 UV板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积，L，200 μL=2×10^-4 L；10⁹：1 mol=1×10⁹ nmol；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；V 样：加入上清液体积，0.02 mL；T：反应时间，1 min；n：样本稀释倍数；W：样品质量，g；V 样总：提取液体积，1 mL；500：细胞总数，500万。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。