细胞核分离提取试剂盒(高纯度)-ExKine™

1. 对于贴壁细胞，用细胞刮刀收获10^7个细胞，然后500 g离心5 min。对于悬浮细胞，500 g离心5 min。

2. 用预冷的PBS重悬细胞沉淀，500 g离心2-3 min，弃上清。

注意：使用移液器小心吸取上清，使细胞沉淀尽可能干燥。

3. 向细胞沉淀中加入1 mL预冷的Lysis Buffer，以最大速度的一半速度将细胞涡旋10 s。

4. 将涡旋至离心管底部的细胞转移至冰冷的匀浆器中，并在2-8℃中破碎细胞，直到细胞核脱离细胞质（通常为15-30次）。将裂解的细胞在冰上孵育5 min。继续步骤III。

注意：用显微镜检查几微升细胞裂解液，以确保细胞裂解均匀并且细胞核中没有胞浆物质。

1. 将10-50 mg组织切成小块，放入离心管中。

2. 用预冷的PBS清洗组织，500 g离心5 min，弃上清。

注意：使用移液器小心吸取上清，使细胞组织尽可能干燥。

3. 加入预冷的1 mL Lysis Buffer，轻轻地重悬组织。

4. 在2-8℃下用匀浆器或组织研磨机将组织匀浆15-30次，并用相差显微镜检查几微升细胞，以确保它们被均匀裂解。继续步骤III。

1. 在冰上操作：每个裂解液样品中加入1 mL冰冷的1.8 M Sucrose Cushion。通过轻轻移液及上下颠倒试管混合。

2. 对于每个样品制备，取干净的超速离心管置于在冰上，将底部添加1 mL冰冷的1.8 M Sucrose Cushion。

3. 小心缓慢地将步骤I或II中的1 mL裂解物溶液置于步骤2中的1.8 M Sucrose Cushion上（避免扰乱蔗糖垫层）。

注意：不同类型的细胞或组织的细胞核可能具有不同的密度，并且可能需要不同浓度的蔗糖才能用于此纯化步骤中的蔗糖垫层，以达到最佳效果。蔗糖浓度可以使用蔗糖稀释液来调节。

4. 小心地将超速离心管放入超速离心机的预冷桶中，4℃下，30,000 g离心45 min。

5. 小心并完全吸弃上清液（细胞质和细胞碎片）和透明的蔗糖垫层，而不会干扰下层纯化的核沉淀。

注意：上清液包含细胞质成分，可以保存以备后用或分析。

6. 轻轻涡旋5 s使核沉淀松散开来。加入200 µL冰冷的Nuclei Storage Buffer，并使用移液器通过反复吹打重悬细胞核（核酸分子首先会结块，但会因持续移液而分散。移液应稳定以及不产生气泡）。

7. 在-80℃或液氮中冷冻储存核。

注意：（1）细胞核应立即使用或在-80℃中冷冻保存。在Nuclei storage buffer中冷冻的细胞核可稳定储存至少几个月。

注意：（2）最终核的数量和纯度可通过台盼蓝计数溶液对核染色，进行显微镜检测来快速确定（建议用2 Nuclei Storage Buffer稀释台盼蓝以防止核膨胀）。细胞核被染成蓝色，具有均匀的圆形或香肠形外观，而细胞质残留和细胞碎片将被染成浅蓝色，并且具有不规则的形态，（如果存在则清晰可见）。