γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存 1个月。样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，以免影响其活力。如果是匀浆液，避免反复冻融。细胞中γ-GT活性测定时，细胞数目须在 300万-500万之间，细胞中γ-GT的提取时可加 Extraction Buffer后超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞（防止因为蛋白质变性导致酶失活）。

1. 组织样本：称取约 0.1 g组织，加入 1 mL Extraction Buffer，进行冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 15 min，取上清，置冰上待测。

2. 细胞、细菌：收集 500万细菌或细胞加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞 3 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s）；然后 8,000 g，4℃，离心 15 min，取上清，置于冰上待测。

注意：如需要进行样本蛋白质浓度测定时，推荐用 Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 405 nm，可见分光光度计用去离子水调零。

2. 工作液置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）水浴中预热 30 min以上（保证无沉淀）。

3. 样本测定：

混匀后，于 405 nm处测定 10 s和 70 s时的吸光度，空白管记为 A1，A2，测定管记为 A3，A4。计算ΔA 测=(A4-A3)-(A2-A1)。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96孔板测定的计算公式

1. 按蛋白浓度计算

活性单位（U）定义：25℃或 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生 1 μmol对硝基苯胺为一个活性单位。

γ-GT (U/mg prot)=[ΔA 测×V 反总÷(ε×d)×10⁶]÷(Cpr×V 样)÷T=2.026×ΔA 测÷Cpr

2. 按样本鲜重计算

活性单位（U）定义：25℃或 37℃中，每克组织每分钟催化产生 1 μmol对硝基苯胺为一个活性单位。

γ-GT (U/g 鲜重)=[ΔA 测×V 反总÷(ε×d)×10⁶]÷(W÷V 样总×V 样)÷T=2.026×ΔA 测÷W

3. 按细菌或培养细胞计算

单位的定义：25℃或 37℃中，每 1万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 μmol对硝基苯胺为一个活性单位。

γ-GT (U/10⁴)=[ΔA 测×V 反总÷(ε×d)×10⁶]÷(500÷V 样总×V 样)÷T=4.053×10^-3×ΔA 测

V 样：加入样品体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：500万细胞和细菌；ε：对硝基苯胺消光系数，9,870 L/mol/cm；d：比色皿光径，0.5 cm；10⁶：单位换算系数，1 mol=10⁶ μmol。

B. 使用微量玻璃比色皿进行测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。