果胶裂解酶(PL)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3 个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 235 nm 处的吸光度）
• 96 孔 UV 板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 恒温水浴锅、分析天平、制冰机、低温离心机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存，若出现沉淀使用前充分摇匀。

Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存，若出现沉淀使用前充分摇匀。

Reagent II：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存，若出现沉淀使用前充分摇匀。

Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h 内完成样品解冻。

1. 植物组织：称取约 0.1 g 样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细菌或真菌：收集 500 万细菌或真菌到离心管内，用冷 PBS 清洗细菌或真菌，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30 次），然后 10,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 培养液：直接检测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用 Abbkine 货号：KTD3001 的蛋白质定量试剂盒（BCA 法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min，调节波长到 235 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。

2. 操作表（下述操作在 96 孔 UV 板或微量石英比色皿中进行）：

40℃孵育 3 min

混匀，40℃反应 30 min

混匀，于 96 孔 UV 板或微量石英比色皿中测定 235 nm 处吸光值 A 对照和 A 测定，计算 ΔA=A 测定-A 对照。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验，每个测定孔需设一个对照孔。如果 ΔA 小于 0.01 可适当加大样本量，如果 A 测定大于 1.5，样本可用 Extraction Buffer 进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用 96 孔 UV 板测定的计算公式如下

1. 按样本蛋白浓度计算：

   酶活性定义：在 40℃，pH 5.5 条件下，每 mg 蛋白每分钟分解果胶产生 1 nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。

   PL (U/mg prot)=128.2×ΔA÷Cpr
2. 按样本鲜重计算：

   酶活性定义：在 40℃，pH 5.5 条件下，每 g 组织每分钟分解果胶产生 1 nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。

   PL (U/g 鲜重)=128.2×ΔA÷W
3. 按细菌或真菌数量计算：

   酶活性定义：在 40℃，pH 5.5 条件下，每 10⁴ 个细菌或真菌每分钟分解果胶产生 1 nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。

   PL (U/10⁴)=128.2×ΔA÷F
4. 按培养液体积计算：

   酶活性定义：在 40℃，pH 5.5 条件下，每 mL 培养液每分钟分解果胶产生 1 nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。

   PL (U/mL)=128.2×ΔA

ε：不饱和半乳糖醛酸摩尔消光系数：5,200 L/mol/cm；d：96 孔 UV 板光径，0.5 cm；V 反总：反应总体积，0.2 mL；V 样：反应体系中样本体积，0.02 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer 体积，1 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，30 min；F：细菌或真菌总数，10⁴ 个。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d: 0.5 cm 调整为 d: 1 cm 进行计算即可。

注意事项

1. 建议一次测定不要测定过多样本以免耽误过多的酶促反应时间。