海藻糖含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

注意：正式检测前，建议选择 2-3个预期差异较大的样本进行预实验。

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 620 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5 mL离心管
• 恒温箱、制冰机、低温离心机
• 去离子水、浓硫酸
• 匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

Reagent I：临用前配制；48 T加入 2.625 mL去离子水，96 T加入 5.25 mL去离子水后，48 T缓慢加入 14.875 mL浓硫酸，96 T缓慢加入 29.75 mL浓硫酸后充分溶解待用。4℃避光保存可稳定 1周。

注意：Reagent I 具有强腐蚀性，请谨慎操作。

Standard：临用前配制；加入 1 mL去离子水充分溶解，配制成 10 mg/mL海藻糖标准品；4℃避光保存可稳定 2周。

1 mg/mL海藻糖标准品制备：100 µL 10 mg/mL海藻糖标准品用 900 µL去离子水稀释；使用 1 mg/mL海藻糖标准品，按照下表所示，进一步稀释成标准品：

注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在 4 h之内使用。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在 4 h内完成样品解冻。

1. 组织

称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，用匀浆器或研钵冰浴匀浆，室温静置 45 min，振荡 3~5次，8,000 g，25℃离心 10 min，取上清液待测。

2. 细胞或细菌

收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞或细菌，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），室温静置 45 min，振荡 3~5次，8,000 g，25℃离心 10 min，取上清液待测。

3. 血清（浆）等液体样本

量取约 0.1 mL样本，加入 1 mL Extraction Buffer，用匀浆器或研钵冰浴匀浆，室温静置 45 min，振荡 3~5次，8,000 g，25℃离心 10 min，取上清液待测。

注意：Extraction Buffer中含有使蛋白变性的成分，若按蛋白浓度计算时，需要用去离子水重新提取蛋白进行测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 620 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

2. 操作表（下述操作在 1.5 mL EP管中操作）：

3. 充分混匀，95℃水浴 10 min（盖紧，防止水分散失），自然冷却至室温，取 200 μL至 96孔板或微量玻璃比色皿中，记录 620 nm处吸光值，空白孔记为 A 空白，标准孔记为 A 标准，测定孔记为 A 测定。计算ΔA 测定=A 测定-A 空白，ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：空白管和标准管只需做 1-2次。实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本的ΔA 测定小于 0.05，可适当增大样本量，如果ΔA 测定大于 1.0或者ΔA 测定超过线性范围吸光值，样本可用 Extraction Buffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

1. 标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA 测定带入方程得到 x (mg/mL)。

2. 海藻糖含量的计算：

（1）按蛋白浓度计算

海藻糖(mg/mg 蛋白)=(V 样×x)÷(V 样×Cpr)=x÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

海藻糖(mg/g 鲜重)=(V 样×x)÷(W×V 样÷V 样总)=x÷W

（3）按照细胞数量计算

海藻糖(µg/104)=(1,000×V 样×x)÷(n×V 样÷V 样总)=1,000x÷n

（4）按样本体积计算：

海藻糖(mg/mL)=(V 样×x)÷(V 液×V 样÷V 样总)=10x

V 样：加入反应体系中样本体积，60 μL=0.06 mL；V 样总：加入 Extraction Buffer体积，1mL；V 液：加入血清（浆）等液体样本体积，0.1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；1,000：1 mg/mL=1,000 µg/mL；n：细菌或细胞总数，以万计。