葡萄糖含量检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见光分光光度计（能测 630 nm处的吸光度）及水浴锅
• 96孔板或微量玻璃比色皿
• 低温离心机、水浴锅
• 可调节式移液枪及枪头
• 去离子水、PBS
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

试剂盒组分

o-Toluidine Reagent: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Glucose Standard (300 mg/dL): 即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。

Standard设置：按下表所示，用去离子水将 Glucose Standard 300 mg/dL稀释为 300、200、100、50、20、10、4 mg/dL的标准溶液。

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL PBS，冰浴匀浆，12,000 g，4℃离心 5 min，取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL PBS 捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20％或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复30次），12,000 g，4℃离心 5 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞或细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL PBS，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 12,000 g，4℃离心 5 min，取上清液，置冰上待测。
4. 血浆，血清和尿液（和其他生物液体）：直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 630 nm，可见光分光光度计用去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在 EP管中操作）：

3. 混匀，在沸水浴中加热 8 min，冷水浴（4℃）中冷却 4 min。取 200 µL到 96孔板或微量玻璃玻璃比色皿，检测 630 nm处吸光值。空白孔记为 A 空，标准孔记为 A 标、测定孔记为 A 测。计算ΔA 测=A 测-A 空，ΔA 标=A 标-A 空。

结果计算

1. 标准曲线的绘制
   以标准溶液浓度为 y轴，ΔA 标为 x轴，绘制标准曲线。
2. Glucose浓度的计算
   将样本的ΔA 测代入方程得到 y值（mg/dL）。

(1) 按样本鲜重计算

Glucose含量(mg/g 鲜重)=y÷100×V 样÷(W×V 样÷V 样总) ×n=y÷100÷W×n

(2) 按样本体积计算

Glucose含量(mg/dL)=y×V 样÷V 样×n=y×n

(3) 按细胞或细菌数量计算

Glucose含量(mg/104)=y÷100×V 样÷(500×V 样÷V 样总)×n=y÷50,000×n

V 样：加入样本体积，0.025 mL；100：1 dL=100 mL；W：样本质量，g；V 样总：加入 PBS体积，1 mL；n：样本稀释倍数；500：细胞或细菌总数，500万。

换算：1 mg/dL葡萄糖等于 55.5 µM，0.001%或 10 ppm。

典型的血清/血浆葡萄糖值：70-110 mg/dL。