D-乳酸脱氢酶(D-LDH)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 450 nm处的吸光度）
• 96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

试剂盒组分

自备耗材

• 恒温水浴锅、制冰机、离心机
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

• Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Reagent I：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Working Reagent II：临用前配制；48 T加入 10 μL Reagent V 和 1.3 mL去离子水，96 T加入 20 μL Reagent V 和 2.6 mL去离子水充分溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃避光保存 1个月，禁止反复冻融。
• Reagent III：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Reagent IV：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
• Reagent V：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。
• Standard：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

标准品制备

使用 100 μmol/mL标准品，按照下表所示，进一步稀释标准品：

样本制备

1. 细菌、细胞或组织样品的制备：

• 细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：Extraction Buffer体积（mL）为500~1000：1的比例（建议 500万细菌或细胞加入 1 mL Extraction Buffer）加入 Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测；
• 组织：按照组织质量（g）：Extraction Buffer体积（mL）为 1：5~10的比例（建议称取约 0.1 g组织，加入 1 mL Extraction Buffer）加入 Extraction Buffer，进行冰浴匀浆。8,000 g，4℃离心 10 min，取上清，置冰上待测。

2. 血清（浆）：

直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min，调节波长到 450 nm。可见分光光度计用去离子水调零。

2. 操作表（下述操作在 1.5 mL EP管中进行）：

充分混匀，37℃水浴 15 min

充分混匀，37℃水浴 15 min

3. 充分混匀，室温静置 30 min，取 200 μL转移至微量玻璃比色皿或 96孔板中于 450 nm处测定吸光度，分别记为 A 测定、A 对照、A 标准、A 空白，计算ΔA 测定=A 测定-A 对照、ΔA 标准=A 标准-A 空白。

结果计算

1. 标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为 x轴，ΔA 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA 测定带入方程得到 x (μmol/mL)。

2. D-LDH活性计算

(1) 按样本体积计算

单位的定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生 1 nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。

(2) 按样本质量计算

单位的定义：每 g组织每分钟催化产生 1 nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。

(3) 按细菌或细胞数量计算

单位的定义：每 104个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。

V 样：反应体系中加入的样本体积，0.01 mL；V 样总：加入的 Extraction Buffer体积，1 mL；T：反应时间，15 min；W：样本质量，g；N：细胞或细菌数量，以万计；103：单位换算系数，1 μmol/mL=103 nmol/mL。