CK肌酸激酶活性检测实验方案：血清、组织与细胞样本的操作流程

肌酸激酶（CK）活性检测的操作步骤不算复杂，但有几个细节需要提前安排好：样本如何处理、反应开始后什么时候读数，以及计算结果时需要记录哪些数据。

尤其是组织称样量、细胞数和蛋白浓度，如果实验时没有记录，后续计算就可能遇到麻烦。

本文以 CheKine™ CK肌酸激酶活性检测试剂盒（微量法，货号 KTB1012） 为例，按照实验当天的操作顺序，介绍血清、动物组织和细胞样本的制备方法、试剂配制、加样步骤及结果计算，并附上试剂用量计算示例和实验记录表，方便实验时参考。

一、开始实验前，先确认三件事

1. 确认样本类型，选择对应的处理方法。

KTB1012 试剂盒适用于动物组织、细胞和血清，不同类型的样本，前处理方式有所区别。

• 动物组织： 需要称样、冰浴匀浆、离心，取上清液检测。

• 细胞： 需要收集细胞、清洗、超声破碎、离心，取上清液检测。

• 血清： 可以直接测定，无需经过组织或细胞的提取步骤。

实验前应先确定样本类型，并准备相应的仪器和耗材。

2. 确定结果报告单位，提前记录相关数据。

CK 活性可以按照组织质量、细胞数量、血清体积或蛋白浓度进行计算。

不同的计算方式，需要的数据也不同：

对于组织和细胞样本，如果需要按照蛋白浓度进行结果归一化，可以使用 BCA 法测定蛋白浓度。

说明书推荐使用亚科因蛋白质定量试剂盒（BCA 法，货号 KTD3001）。

建议在样本处理前就建好记录表，避免检测完成后缺少计算所需的数据。

3. 正式检测前，先做预实验。

说明书建议选择 2–3 个预期差异较大的样本进行预实验。

预实验可以帮助判断样本的吸光度变化是否处于合适范围，并为后续的样本用量或稀释安排提供参考。

尤其是预期 CK 活性较高的样本，先确认检测范围，再开展正式实验会更方便。

二、实验前需要准备哪些仪器和试剂？

根据 KTB1012 说明书，实验需要使用能够在 340 nm 处测量吸光度的酶标仪，并配合 96 孔 UV 板进行检测。

1. 仪器与耗材

组织样本还需要使用天平进行称样。

2. 试剂盒组分

KTB1012 提供 48 T 和 96 T 两种规格。

试剂盒整体保质期为 -20℃避光保存 6 个月，具体组分应按照表中的条件分别储存。

说明书注明，各组分在规格基础上额外提供 10% 的试剂量，用于标准曲线制作或预实验。实验前仍应检查各组分的实际用量是否满足检测需求。

3. 做好实验防护

生化检测试剂普遍可能具有刺激性或生物毒性，其中 Working Reagent Ⅰ 和 Reagent Ⅱ 也有一定刺激性。

实验过程中应穿戴实验服、口罩、手套、头套等防护用品，并按照说明书要求在通风橱或生物安全柜中操作。

三、肌酸激酶（CK）活性检测的具体操作流程

第一步：准备仪器和检测试剂

先打开酶标仪，按照说明书设置检测条件。

• 预热时间：30 min 以上。

• 检测温度：37℃。

• 检测波长：340 nm。

接下来准备各组分试剂。

Extraction Buffer

即用型试剂，不需要额外配制，使用前平衡至室温，平时在 4℃保存。

Working Reagent Ⅰ

Reagent Ⅰ 为粉剂，需要在使用前加入去离子水，配制成 Working Reagent Ⅰ。

具体配制方法如下：

加入去离子水后充分溶解。

未使用完的 Working Reagent Ⅰ 可在 -20℃避光保存 1 个月，注意避免反复冻融。

Reagent Ⅱ

即用型试剂，使用前平衡至室温，平时在 4℃保存。

需要区分的是，Reagent Ⅰ 粉剂、配制后的 Working Reagent Ⅰ 以及后面混合得到的 Working Solution，保存和使用要求并不相同，应分别按照说明书操作。

第二步：制备待测样本

说明书推荐使用新鲜样本。

如果当天无法提取，可将完整细胞或分装后的组织块保存在 -80℃，一个月内使用。

后续进行检测时，将样本从 -80℃取出，在冰上解冻。但冷冻保存可能影响样本稳定性，测得的活性可能低于预期。

血清中的 CK 稳定性较差，采样后应尽快测定。按照说明书，血清在 4℃避光条件下可稳定保存 24 h。

说明书还要求，测定过程中样本和试剂应置于冰上，以减少变性和失活的影响；对于另有室温平衡或 37℃孵育要求的试剂步骤，按相应规定执行。

1. 动物组织样本

按照以下步骤处理：

1. 称取约 0.1 g 动物组织。

2. 加入 1 mL Extraction Buffer。

3. 在冰浴条件下进行匀浆。

4. 10000 g、4℃离心 10 min。

5. 取上清液，置于冰上待测。

组织样本要记录实际称样量 W，单位为 g，后续按组织质量计算 CK 活性时需要使用。

2. 细胞样本

细胞样本按照说明书进行收集、清洗和破碎。

1. 收集 5×10⁶ 个细胞。

2. 使用冷 PBS 清洗细胞。

3. 800 g 离心 2 min，弃去上清。

4. 加入 1 mL Extraction Buffer。

5. 在冰浴条件下超声波破碎 5 min。

6. 10000 g、4℃离心 10 min。

7. 取上清液，置于冰上待测。

其中，超声破碎条件为：

• 功率：20% 或 200 W。

• 超声时间：3 s。

• 间隔时间：7 s。

• 重复次数：30 次。

整个超声处理过程为 5 min。

如果后续按细胞数量计算活性，需要记录细胞数量。对于 5×10⁶ 个细胞，计算公式中的 N = 500。

3. 血清样本

血清样本可以直接测定，不需要经过上述组织匀浆或细胞破碎步骤。

由于血清中的 CK 不稳定，建议采集后尽快完成检测。

如果组织或细胞样本还需要按照蛋白浓度计算 CK 活性，应同时安排相应提取上清的蛋白定量。

第三步：配制 Working Solution

完成样本准备后，根据实际检测孔数配制 Working Solution。

按照 KTB1012 说明书，将 Working Reagent Ⅰ 和 Reagent Ⅱ 按 1:1 的比例充分混合。

Working Solution 需要现用现配，并置于 37℃孵育 2 min。

每孔需要使用 Working Solution 100 μL。

因此，每孔对应的组分用量为：

• Working Reagent Ⅰ：50 μL。

• Reagent Ⅱ：50 μL。

一次需要配多少 Working Solution？

可以按照检测孔数、空白孔数和预留余量计算。

Working Solution 总量 =（测定孔数 + 空白孔数 + 余量孔数）×100 μL

其中，两种试剂各占一半。

举个例子。

假设需要检测 6 个血清样本，每个样本设置 1 个测定孔，并设置 1 个空白孔。

实际需要 7 个孔。

如果额外预留 1 个孔的试剂余量，则按照 8 个孔计算：

Working Solution 总量：

8×100 μL = 800 μL

需要：

• Working Reagent Ⅰ：400 μL。

• Reagent Ⅱ：400 μL。

6 个血清样本的实际加样量为：

6×40 μL = 240 μL

这样就可以提前估算这一批次的试剂用量。

需要说明的是，上述批次及余量计算属于操作示例，不是说明书规定必须采用的检测批次大小。

第四步：按照加样表配制检测体系

使用 96 孔 UV 板，按照说明书给出的体系加样。

空白孔只需做 1–2 次。

测定孔加入 40 μL 待测样本，空白孔不加入样本，以去离子水补足对应体积。

每个孔的最终反应总体积均为 200 μL。

第五步：混匀并读取吸光度

加样完成后，迅速混匀，在 340 nm、37℃条件下进行吸光度检测。

分别记录反应 5 min 和 10 min 时的吸光值。

• 5 min 的吸光度记为 A₁。

• 10 min 的吸光度记为 A₂。

• 空白孔数据记为 A空白。

• 测定孔数据记为 A测定。

也就是说，每个测定孔需要记录 A₁测定 和 A₂测定，空白孔则需要记录 A₁空白 和 A₂空白。

这一步需要特别留意反应时间。

CK 活性是根据单位时间内吸光值的变化计算得到的。说明书明确指出，不推荐同时测定多个样本。

因此，样本数量较多时，应根据仪器的定时读数能力合理安排检测，确保记录的数据对应规定的反应时间。

对于可以进行定时或动力学读数的酶标仪，可以结合仪器功能设置相应时间点；具体操作方式应以仪器说明为准。

四、肌酸激酶（CK）活性结果怎么计算？

完成吸光度检测后，先计算扣除空白变化的 ΔA，再根据样本类型选择公式。

1. 计算吸光度变化值

按照说明书：

ΔA测定 =（A₂测定 − A₁测定）−（A₂空白 − A₁空白）

这里使用的是两个时间点之间的吸光度变化，并扣除了空白孔在相同时间段内的变化。

2. 按不同样本类型计算 CK 活性

KTB1012 说明书给出了四种计算方式。

（1）按组织质量计算

CK（U/g）= 321.5 × ΔA测定 ÷ W

其中：

W 为组织实际称样量，单位为 g。

该单位定义为：37℃、pH 7.0 时，每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADPH，定义为一个酶活力单位。

（2）按细胞数量计算

CK（U/10⁴ cells）= 321.5 × ΔA测定 ÷ N

其中：

N 为细胞数量，以 10⁴ 个细胞为单位。

例如，5×10⁶ 个细胞对应 N = 500。

该单位定义为：37℃、pH 7.0 时，每 10⁴ 个细胞每分钟生成 1 nmol NADPH，定义为一个酶活力单位。

（3）按液体体积计算

CK（U/mL）= 321.5 × ΔA测定

该公式用于按照血清体积计算 CK 活性。

单位定义为：37℃、pH 7.0 时，每毫升血清每分钟生成 1 nmol NADPH，定义为一个酶活力单位。

（4）按蛋白浓度计算

CK（U/mg prot）= 321.5 × ΔA测定 ÷ Cpr

其中：

Cpr 为蛋白浓度，单位 mg/mL。

单位定义为：37℃、pH 7.0 时，每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH，定义为一个酶活力单位。

以上均为说明书给出的简洁计算公式。

3. 公式中的 321.5 是什么？

321.5 是根据说明书所列反应体系参数推导得到的计算系数。

涉及的参数包括：

上述简洁公式对应说明书规定的反应体系和参数。

关于 CK 活性检测的偶联反应过程，可以参考《肌酸激酶（CK）活性检测原理：偶联反应法测的到底是什么？》。

此外，亚科因官网（abbkine.cn）“技术中心”提供了在线计算器，可以输入相应数据进行计算。

五、实验数据怎么记录？附计算示例

建议实验时直接填写记录表，避免检测完成后再整理数据出现遗漏。

由于空白孔通常由同一批次共用，可以将空白孔数据单独记录。

1. 空白孔记录表

如果设置了两个空白孔，建议分别保存原始读数。

2. 样本检测记录表

W、N 和 Cpr 分别对应组织质量、细胞数量和蛋白浓度，实际实验时根据计算方式填写。

3. 以小鼠血清为例，演示计算

说明书提供了一组小鼠血清检测数据。

测得：

• A₁测定 = 0.670

• A₂测定 = 0.907

• A₁空白 = 0.052

• A₂空白 = 0.054

先计算 ΔA测定：

ΔA测定 =（0.907 − 0.670）−（0.054 − 0.052）

ΔA测定 = 0.235

再代入血清 CK 活性计算公式：

CK（U/mL）= 321.5 × 0.235

得到：

CK 活性 = 75.55 U/mL

这个示例来自 KTB1012 说明书，可用于对照理解计算过程，不代表所有小鼠血清样本都应得到相同的结果。

六、检测中遇到 ΔA 过高或过低怎么办？

正式检测时，有时会出现吸光度变化值过高或过低的情况。

KTB1012 说明书针对这两种情况给出了处理方法。

如果样本的 CK 活性预计较高，可以通过预实验观察检测情况，再决定是否需要进行稀释。

需要注意，说明书没有统一规定不同样本的初始稀释倍数，因此不宜将某个倍数作为所有样本的固定操作要求。

具体稀释方案或样本量调整存在疑问时，可联系亚科因技术人员咨询。

七、还有哪些操作细节需要留意？

除了说明书中的具体要求，下面几项属于微量酶活检测中的通用操作经验，可作为实验记录和操作时的辅助参考。

1. 移液量不大，尽量保持操作一致。

检测体系中，每孔样本量为 40 μL，去离子水为 60 μL。

移液时尽量保持操作手法一致，减少不同孔之间的移液偏差。

2. 读数前检查孔内是否存在气泡。

混匀过程中如果产生气泡，可能影响吸光度测量。

建议读数前观察孔内情况，尽量避免气泡干扰。

3. 记录实际加样和读数时间。

说明书要求记录 5 min 和 10 min 的吸光度。

如果仪器操作允许，也可以额外记录各样本加入 Working Solution 的时间，以及实际读数时间。

当某个样本结果出现异常时，这些信息可以辅助排查时间控制方面的问题。

4. 样本较多时，合理安排检测批次。

说明书不推荐同时检测多个样本，主要是因为 CK 活性计算依赖单位时间内的吸光度变化。

实际操作中，应结合仪器功能、加样速度和读数方式安排检测，避免因反应时间不一致影响结果。

这些通用经验不替代产品说明书中的规定。涉及试剂配制、加样体系、孵育条件和计算公式时，仍应以说明书为准。

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本文根据产品说明书整理，操作经验部分仅供实验参考。实际检测请以对应批次产品随附说明书为准。本产品仅供科学研究使用，不适用于临床诊断。