CK肌酸激酶活性检测原理：偶联反应法测的到底是什么？
肌酸激酶（CK，EC 2.7.3.2）催化的是肌酸与ATP之间的转磷酰基反应，但这个反应本身并不容易直接通过吸光度检测。磷酸肌酸、ADP、肌酸和ATP在常规紫外或可见光检测条件下，都没有一个适合用来直接测定CK反应速度的特征信号。要测定CK活性，就需要把它的催化反应转化成能够读取的吸光度变化。
肌酸激酶（CK）活性检测试剂盒采用的偶联反应法，就是在CK反应之后接入两个酶，让反应继续进行，最终生成NADPH，再通过NADPH在340 nm处的吸光度变化进行检测。
这篇文章主要讲清楚三个问题：偶联反应中的每一步在做什么？为什么吸光度变化能够代表CK活性？从吸光度变化到最终的酶活性单位，又是怎么换算的？
一、三步反应，怎么接力
检测体系中发生的是三个连续的酶促反应：
CK：磷酸肌酸 + ADP → 肌酸 + ATP
己糖激酶（HK）：ATP + 葡萄糖 → ADP + 6-磷酸葡萄糖
6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）：6-磷酸葡萄糖 + NADP⁺ → 6-磷酸葡萄糖酸内酯 + NADPH + H⁺
三步反应加起来，净结果是：
磷酸肌酸 + 葡萄糖 + NADP⁺ → 肌酸 + 6-磷酸葡萄糖酸内酯 + NADPH + H⁺
理解这条反应链，需要注意几个细节。
第一，检测的是CK催化磷酸肌酸生成ATP的方向。
CK是一种可逆酶，既能催化磷酸肌酸与ADP反应生成肌酸和ATP，也能催化反方向的反应。这套检测体系测定的是前一个方向。
第二，ADP可以循环利用。
CK在第一步消耗ADP，己糖激酶在第二步将ATP转化为ADP，生成的ADP又可以回到第一步继续参与反应。
第三，最终的读数来自NADPH。
NADPH在340 nm处具有特征吸收，而NADP⁺在这一波长下的吸收很弱。因此，随着NADPH不断生成，340 nm处的吸光度也会相应升高。
根据上述反应的化学计量关系，在偶联反应正常进行的前提下，CK每催化一次反应，最终就会对应生成一个NADPH。因此，NADPH的生成速度可以用来反映CK的催化活性。
不过，这里有一个重要前提：后面两步偶联反应不能成为整个体系的限速步骤。
如果HK或G6PDH的反应速度不足，最终测到的就可能是后续反应的速度，而无法准确反映CK的实际活性。
因此，偶联酶活性测定通常需要保证辅助酶和相关底物满足反应要求，让待测CK成为决定反应速度的主要因素。
二、为什么看的是“速度”，而不是某一时刻的吸光度
酶活性的本质是催化反应速度，因此，这种检测方法关注的不是某一时刻的吸光度绝对值，而是吸光度随时间发生了多少变化。
按照本文采用的检测方案，反应在37℃条件下进行，混匀后于340 nm分别在5 min和10 min读取一次吸光度，记为A₁和A₂。
两次读数之差，反映的是这段时间内NADPH的生成量。
实验中还需要设置空白孔。空白孔使用去离子水代替样本，其余反应条件相同，同样在5 min和10 min读取A₁和A₂。
最终用于计算的ΔA为：
ΔA测定 =（A₂测定 − A₁测定）−（A₂空白 − A₁空白）
也就是说，先计算测定孔的吸光度变化，再扣除空白孔在相同时间内的变化量。
这样可以减少反应试剂本身吸光度变化对结果的影响。
这里还有一个容易忽略的地方：计算系数中的反应时间T，指的是从第5分钟到第10分钟的这段时间，也就是5 min，而不是从反应开始到第二次读数的10 min。
因此，本文所用计算方法中的读数时间点按5 min和10 min固定使用。如果实验需要调整读数时间，应先与技术人员确认，不能直接沿用原来的计算系数。
三、从ΔA到酶活力单位：321.5是怎么来的
在本文采用的计算方法中，321.5是一个反复出现的数字。
它并不是经验常数，而是根据反应总体积、样本体积、NADPH摩尔消光系数、光径和反应时间等参数计算得到的。
具体参数如下：
| 参数 | 含义 | 数值 |
|---|---|---|
| V反总 | 反应体系总体积 | 0.2 mL = 2×10⁻⁴ L |
| ε | NADPH的摩尔消光系数 | 6.22×10³ L/mol/cm |
| d | 光径 | 0.5 cm |
| V样本 | 反应体系中样本的体积 | 0.04 mL |
| T | 反应时间 | 5 min |
| 10⁹ | 单位换算系数 | 1 mol = 10⁹ nmol |
计算依据是朗伯-比尔定律：
A = ε × c × d
其中，A表示吸光度，ε表示摩尔消光系数，c表示物质浓度，d表示光径。
整个换算可以分为三步。
第一步：根据吸光度变化计算NADPH浓度变化。
当ΔA = 1时：
Δc = 1 ÷（6.22×10³ × 0.5）
≈ 3.215×10⁻⁴ mol/L
也就是说，吸光度每变化1，对应NADPH的浓度变化约为3.215×10⁻⁴ mol/L。
第二步：将浓度变化换算成NADPH的生成量。
反应体系总体积为0.2 mL，即2×10⁻⁴ L。
将浓度变化乘以反应总体积，再换算成nmol：
3.215×10⁻⁴ × 2×10⁻⁴ × 10⁹
≈ 64.3 nmol
因此，ΔA每变化1，对应整个反应体系生成约64.3 nmol NADPH。
第三步：换算成单位时间、单位样本体积的酶活性。
这些NADPH是0.04 mL样本在5 min内生成的，因此：
64.3 ÷（0.04 × 5）= 321.5
单位为nmol/min/mL。
这就得到了计算公式中的321.5。
按照本文采用的酶活力单位定义，在37℃、pH 7.0时，每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
不同样本类型，为什么计算公式不一样？
实际检测中，样本可能是组织、细胞，也可能是血清。虽然都通过ΔA计算CK活性，但结果需要按照不同的样本基准进行表示。
四种常见结果表示方式采用同一个321.5，区别主要在于最终需要除以什么。
以组织质量计算为例：
假设称取W克组织，加入V提取（mL）提取液进行提取，取40 μL上清液用于检测。
这40 μL上清液对应的组织质量为：
W ÷ V提取 × 0.04（g）
代入计算关系后，可以得到：
CK（U/g）= 321.5 × ΔA × V提取 ÷ W
如果按照约0.1 g组织加入1 mL提取液的方法制备样本，则V提取 = 1 mL，公式可以简化为：
CK（U/g）= 321.5 × ΔA ÷ W
如果实际实验改变了提取液体积，就需要使用包含V提取的完整公式。
按细胞数量计算时，也是同样的换算思路。
不同结果表示方式对应的公式如下：
| 表示方式 | 完整式 | V提取 = 1 mL时 | 分母的含义 |
|---|---|---|---|
| U/g | 321.5 × ΔA × V提取 ÷ W | 321.5 × ΔA ÷ W | 组织质量W（g） |
| U/10⁴ cells | 321.5 × ΔA × V提取 ÷ N | 321.5 × ΔA ÷ N | 细胞数N，以10⁴为单位 |
| U/mL | 321.5 × ΔA | 同左 | 血清直接测定，没有额外分母 |
| U/mg prot | 321.5 × ΔA ÷ Cpr | 同左 | 蛋白浓度Cpr（mg/mL） |
注：V提取的单位为mL。
以小鼠血清为例，如果测得ΔA测定 = 0.235，则：
CK = 321.5 × 0.235
= 75.55 U/mL
这个结果表示该血清样本在规定检测条件下测得的CK催化活性。
四、读这个数字时，要记住的几个边界
321.5不是通用常数。
它由反应总体积、样本体积、光径和反应时间等参数共同决定。
如果其中任何一个参数发生变化，计算系数就需要根据实际条件重新计算。
例如，实验室改用分光光度计，或者按比例调整反应试剂的用量，都不能直接套用321.5。具体调整方案应先与技术人员确认。
它测量的是活性，不是CK蛋白含量。
CK活性反映的是CK在规定条件下的催化能力，而蛋白含量反映的是样本中CK蛋白的多少。
即使两个样本含有相同数量的CK蛋白，在不同实验条件下，也可能表现出不同的催化活性。
因此，试剂盒测得的是37℃、pH 7.0条件下的CK催化速度，不能直接理解为样本中CK蛋白的质量浓度。
ΔA需要处于合适的检测范围。
该方法的计算建立在吸光度变化与NADPH生成量成正比的基础上。因此，检测时应确保ΔA处于适合测定的范围。
按照本文采用的检测方案：
当ΔA测定大于0.8时，可以使用Extraction Buffer适当稀释样本后重新检测，或者减少用于提取的样本量。
当ΔA测定小于0.05时，可以适当提高样本量。
如果尚不清楚样本中的CK活性水平，建议先通过预实验确定合适的检测范围，再进行正式测定。
五、在CheKine™ KTB1012里
CheKine™ CK肌酸激酶活性检测试剂盒（微量法，货号KTB1012）采用上述偶联反应原理，通过检测340 nm处NADPH吸光度的变化来计算CK活性。
该试剂盒适用于动物组织、细胞和血清样本。
检测所需的反应试剂由Reagent Ⅰ和Reagent Ⅱ组成。其中，Reagent Ⅰ为粉剂，使用前需加入去离子水，配制成Working Reagent Ⅰ。
随后，将Working Reagent Ⅰ与Reagent Ⅱ按1:1混合，配制成Working Solution，现用现配。
检测在96孔UV板中进行，每孔反应总体积为200 μL，检测波长为340 nm。
按照规定时间读取吸光度后，即可根据测定孔与空白孔的吸光度变化，计算样本中的CK活性。
KTB1012同时提供了官网在线计算器，输入相应的吸光度数据后，可以辅助完成检测结果计算。
对于希望减少手动计算步骤的实验人员，可以使用这一工具，但仍需要确保输入数据与实际检测条件一致。
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本文内容以产品随附说明书为准。本产品仅供科学研究使用，不适用于临床诊断。
