GSSG氧化型谷胱甘肽检测与铁死亡研究：谷胱甘肽指标怎么选、怎么搭配
做铁死亡实验，Fe²⁺、MDA、GPX4、GSH 这几个指标大家都比较熟悉。但轮到氧化型谷胱甘肽（GSSG），有时就不知道该不该测了。
已经测了 GSH，还有必要加 GSSG 吗？两者是不是一定一个升、一个降？如果想计算 GSH/GSSG 比值，又该怎么选择试剂盒？
这些问题要结合具体实验来看。
铁死亡研究常用的指标可以分成三类：
铁代谢相关指标：Fe²⁺、FerroOrange 荧光染色等；
脂质过氧化相关指标：MDA、脂质 ROS 等；
抗氧化防御相关指标：GPX4、GSH、GSSG 等。
GSSG 属于第三类。它能反映谷胱甘肽氧化还原体系的变化，但不能单独用来判断铁死亡。
下面结合一篇脑出血铁死亡研究，看看 GSSG 在实验中起到了什么作用，以及不同研究条件下该如何搭配检测指标。
一、先看一篇文献：脑出血铁死亡实验测了哪些指标？
2024 年，Lv 等人在 CNS Neuroscience & Therapeutics 发表了一篇研究：
DMT1 ubiquitination by Nedd4 protects against ferroptosis after intracerebral hemorrhage.
研究主要关注一个问题：Nedd4 能否通过促进 DMT1 泛素化降解，减轻脑出血（ICH）后的铁死亡？
研究人员建立了两种模型：
动物模型：向小鼠纹状体注射胶原酶 VII，诱导脑出血。
细胞模型：使用 40 μM hemin 处理 HT22 细胞 24 h。
为了观察铁死亡相关变化，研究人员并没有只测一个指标，而是同时检测了铁、脂质过氧化和抗氧化防御相关指标。
其中：
Fe²⁺、MDA、GSSG 和 GSH 采用试剂盒检测，GPX4 通过 Western blot 检测。
文章中使用的部分 Abbkine 试剂盒包括：
此外，研究人员还进行了 FerroOrange 染色、ROS 和脂质 ROS 检测（BODIPY-C11 流式分析），并利用透射电镜观察线粒体形态。
这些指标最后测出了什么结果？
根据文献报告，几组主要实验的指标变化方向如下：
| 实验比较 | Fe²⁺ | MDA | GSSG | GSH | GPX4 |
|---|---|---|---|---|---|
| ICH 后，DMT1 敲低组相对于对照组 | ↓ | ↓ | ↓ | ↑ | ↑ |
| ICH 后，Nedd4 过表达组相对于对照组 | ↓ | ↓ | ↓ | ↑ | ↑ |
| ICH 后，DMT1 3KR 突变组相对于 DMT1 野生型组（均过表达 Nedd4） | ↑ | ↑ | ↑ | ↓ | ↓ |
注：箭头仅表示文献报告的变化方向，具体数值及统计结果见原文图表。
可以看到，DMT1 敲低或 Nedd4 过表达后，Fe²⁺、MDA 和 GSSG 水平下降，而 GSH、GPX4 水平升高。
当研究人员引入不易被 Nedd4 泛素化的 DMT1 3KR 突变体后，这些指标又出现了相反的变化。
细胞实验也观察到了类似结果。
在 hemin 处理的 HT22 细胞中，Nedd4 过表达后 FerroOrange 荧光减弱，MDA 和 GSSG 降低，GSH 和 GPX4 升高；引入 DMT1 3KR 突变体后，相关变化方向则相反。
为什么这里同时检测 GSH 和 GSSG？
因为两者提供的信息不完全相同。
GSH 是还原型谷胱甘肽，参与细胞抗氧化防御；GSSG 是氧化型谷胱甘肽，可用于观察谷胱甘肽体系的氧化还原变化。
在这项研究中，两者呈现出相反的变化方向。
如果只测 GSH，可以知道还原型谷胱甘肽水平发生了变化。加测 GSSG 后，还能观察氧化型谷胱甘肽是否也发生了相应改变。
结合 Fe²⁺、MDA、GPX4 和其他实验结果，可以更完整地分析这一模型中的铁死亡相关变化。
不过，这种 GSH 下降、GSSG 升高的组合，并不是所有铁死亡模型都会出现。
二、GSH、GSSG 和 GSH/GSSG 比值，究竟应该测哪个？
不少实验方案习惯把铁死亡和下面这组变化联系起来：
GSH 下降、GSSG 升高、GSH/GSSG 比值下降。
这种情况确实存在，前面介绍的脑出血研究就是一个例子。
但如果改变铁死亡的诱导方式，实验结果可能不一样。
1. 使用 erastin 诱导铁死亡：重点关注 GSH 是否耗竭
Erastin 主要通过抑制 system Xc⁻ 介导的胱氨酸摄取，影响细胞内 GSH 的合成。
GSH 供应不足后，GPX4 缺少发挥抗氧化作用所需的底物，脂质过氧化物更容易积累。
在这种实验中，GSH 和总谷胱甘肽（T-GSH）是比较直接的观察指标。
如果还想分析谷胱甘肽体系的氧化还原变化，可以进一步检测 GSSG。
但要注意，GSH 减少不一定全部意味着它被氧化成了 GSSG，也可能与合成受阻有关。
2. 使用 RSL3 诱导铁死亡：GSH/GSSG 比值未必下降
RSL3 与 erastin 的主要作用位置不同。
RSL3 可以直接抑制 GPX4 活性。由于 GPX4 参与利用 GSH 还原脂质过氧化物的过程，它受到抑制后，相关的 GSH 氧化过程也会发生变化。
因此，RSL3 诱导铁死亡时，不能预先认定 GSH 一定下降、GSSG 一定升高。
Kim 等人在 2023 年发表于 Scientific Reports 的研究中，就观察到了不同于常见预期的结果。
在非小细胞肺癌细胞模型中，RSL3 处理后，GSH/GSSG 比值反而升高。
研究人员进一步敲低 GPX4，也观察到了比值升高的现象，同时伴有细胞内游离铁水平和 ROS 水平的增加。
这说明，GSH/GSSG 比值不能脱离 GPX4 的状态，单独按照升高或下降来判断铁死亡。
当然，这并不意味着使用 RSL3 就一定会使比值升高。
不同细胞类型、处理浓度、作用时间以及细胞本身的代谢状态，都可能影响最终读数。
如果研究重点就在 GPX4 这一环，建议把 GSH、GSSG 或两者的比值与 GPX4、脂质过氧化指标一起分析。
3. 脑出血、铁富集等复杂损伤模型：GSH 和 GSSG 都值得关注
脑出血、缺血再灌注以及铁富集相关损伤，往往涉及多条生物学过程。
铁代谢发生变化的同时，脂质过氧化、氧化应激和抗氧化防御体系也可能受到影响。
这种情况下，同时检测 GSH、GSSG、MDA 和 GPX4，通常比只测一个谷胱甘肽指标能提供更多信息。
前面介绍的 Lv 等人的研究，就是采用这种组合。
需要明确的是，GSSG 并不是铁死亡特有的指标。其他氧化应激过程同样可能引起 GSSG 变化。
因此，检测到 GSSG 升高，只能说明谷胱甘肽氧化还原体系可能发生了变化，不能直接得出“发生铁死亡”的结论。
三、如果想算 GSH/GSSG 比值，该怎么测？
这里容易出现一个问题：实验已经分别测了 GSH 和 GSSG，后面才想起来要计算比值。
理论上，只要两项数据的样本来源、单位和归一化方式一致，就可以计算。
但如果两项检测使用了不同批次的样本，或者提取、保存条件存在差异，比值的解释就可能受到影响。
因此，准备研究 GSH/GSSG 比值时，最好在实验设计阶段就确定检测方案。
一种选择是采用 T-GSH 和 GSSG 联合检测。
以 CheKine™ T-GSH/GSSG检测试剂盒（KTB1671）为例，可以在同一份样本提取上清的基础上，分别检测总谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽。
当 T-GSH 以 GSH 当量表示、GSSG 以分子浓度表示且单位一致时，可以按照以下关系计算：
GSH = T-GSH − 2 × GSSG
再进一步计算：
GSH/GSSG = (T-GSH − 2 × GSSG) / GSSG
之所以需要乘以 2，是因为一分子 GSSG 由两个谷胱甘肽单元构成。
计算时需要统一浓度或含量单位，并以具体产品说明书规定的结果表达方式为准。
如果实验已经确定只需要 GSH 或 GSSG 的绝对含量，也可以选择对应的单项检测试剂盒，不必为了计算比值额外增加检测。
四、做铁死亡实验测 GSSG，有几个样本问题要提前考虑
铁死亡实验中的 GSSG 检测，除了选择指标，还要注意样本本身的特点。
尤其是 hemin 处理细胞和脑出血组织，与普通细胞样本相比，存在一些需要提前确认的问题。
1. 铁含量较高，会不会影响 GSSG 检测？
这是铁死亡实验中比较实际的问题。
部分模型需要添加铁剂、hemin，或者样本本身就存在铁富集。
KTB1610 的检测过程涉及谷胱甘肽还原酶及显色反应，产品使用时需要注意铁离子等物质可能造成的干扰。
对于 hemin 处理的细胞，可按适用说明书要求，在提取前使用预冷 PBS 清洗两次，以减少培养体系残留。
但清洗不能保证已经进入细胞内部的相关物质完全去除。
前面介绍的 Lv 等人的研究，确实使用 KTB1610 检测了 hemin 处理的 HT22 细胞，以及脑出血小鼠的脑组织。
不过，文章没有专门报告样本中铁离子对 GSSG 检测的干扰验证。
所以，如果样本铁含量明显偏高，或者处理过程中使用了可能影响检测反应的试剂，建议先确认基质干扰情况，必要时进行预实验，并向技术支持核实具体处理方法。
2. 脑出血组织取材，不能忽略残留血液
做 ICH 模型时，取材部位会直接影响实验结果。
例如，血肿核心与血肿周围组织的成分并不完全相同。
脑出血后，血液进入脑实质，而红细胞本身也含有谷胱甘肽。
如果不同实验组取材区域不一致，混入的血液成分可能不同，进而影响 GSH 和 GSSG 检测结果。
即使进行了灌流，也不能认为已经清除了所有血液成分。灌流主要清除血管内的血液，不能完全去除已进入脑实质的血液。
Lv 等人的文章讨论了脑出血后铁沉积与氧化损伤的关系，但没有在相应试剂盒检测方法中详细说明具体取材区域。
因此，设计这类实验时，建议提前统一取材区域，并在实验方法中写清楚。
尤其要区分血肿核心与血肿周围组织，避免把取材差异误认为处理因素带来的变化。
3. 小鼠脑区样本量少，能否按比例缩小提取体系？
KTB1610 推荐的常规组织处理比例为：
0.1 g 组织加入 1 mL 提取液。
但如果只取小鼠某个脑区，实际样本量可能远小于 0.1 g。
这时，实验人员往往会考虑等比例缩小提取体系。
例如，Monirujjaman 等人在 2022 年发表于 Cancers 的研究中，采用过约 30 mg 肝组织、按 1:10（w）比例匀浆的处理方式。
不过，肝组织与脑组织的实际检测条件并不完全相同，不能直接认为该比例适用于所有小鼠脑区样本。
对于 KTB1610，在推荐的 0.1 g 组织加 1 mL 提取液条件下，组织样本对应的可检测含量范围约为 7.8–250 nmol/g。
产品资料中还给出了兔脑组织 GSSG 含量为 51.41 nmol/g 的参考示例。
这些数据可以帮助估算样本需求，但小鼠 ICH 组织的实际含量仍应通过预实验确认。
如果需要调整取样量或提取液体积，也要同步调整后续计算参数，避免样本处理方法变了，结果却仍按原公式计算。
4. GSSG 检测为什么要注意处理速度？
GSH 和 GSSG 会受到样本处理条件的影响。
如果取材后放置时间过长，或者提取过程中发生额外氧化，原本的 GSH/GSSG 状态就可能改变。
这类变化发生在检测之前，后续即使严格按照显色步骤操作，也不能完全消除影响。
因此，建议优先使用新鲜样本，按说明书要求进行低温提取，并尽量缩短取材至处理完成的时间。
以 KTB1610 为例，产品资料允许处理后的待测样本在 -80℃ 条件下保存约一个月。
但如果同一实验还要检测 GSH，需要分别核对所用试剂盒的保存要求，不能默认所有谷胱甘肽试剂盒都适用同一个保存期限。
不同实验组还应尽量保持一致的取材、提取、保存和冻融条件。
五、GSSG、GSH、MDA 试剂盒，实际应该怎么搭配？
理解了各项指标的用途，选试剂盒就比较清楚了。
可以先确定实验到底需要哪一类数据，再选择对应产品。
| 实验需求 | 对应产品及货号 |
|---|---|
| 单独检测 GSSG 含量 | KTB1610，GSSG 含量检测试剂盒 |
| 检测总谷胱甘肽 T-GSH | KTB1670，T-GSH 含量检测试剂盒 |
| 联合检测 T-GSH、GSSG，并计算 GSH 和比值 | KTB1671，T-GSH/GSSG 含量检测试剂盒 |
| 单独检测还原型谷胱甘肽 GSH | KTB1600，GSH 检测试剂盒 |
| 检测脂质过氧化相关产物 MDA | KTB1050，MDA 检测试剂盒 |
| 检测 Fe²⁺、脂质 ROS、GPX4 等 | 根据检测方法另行选型，具体货号待确认 |
对于铁死亡研究，可以按下面几种情况考虑。
如果只关注 GSSG 的变化：
选择 KTB1610 即可，再根据研究目的搭配其他铁死亡相关指标。
如果需要分别报告 GSH 和 GSSG 含量：
可以参考 Lv 等人的做法，使用 KTB1600 + KTB1610。
该研究分别报告了 GSH 和 GSSG 的结果，并没有进一步计算 GSH/GSSG 比值。
如果研究重点是 GSH/GSSG 比值：
可以优先考虑 KTB1671。
同一份样本提取上清可分别用于 T-GSH 和 GSSG 检测，再按规定的计算关系得到 GSH 及其比值，便于统一检测口径。
最后还要回到研究目的。
如果研究的是 erastin 对谷胱甘肽合成的影响，可以重点关注 GSH 和 T-GSH；如果研究的是 RSL3 对 GPX4 的影响，就要结合 GPX4 和脂质过氧化指标解释谷胱甘肽数据。
对于脑出血、铁富集等复杂损伤模型，同时观察 GSH、GSSG、MDA、Fe²⁺ 和 GPX4，能够从不同角度分析实验变化。
GSSG 有没有必要测，取决于实验需要回答什么问题。
它可以帮助观察谷胱甘肽氧化还原体系的变化，但无论 GSSG 升高还是降低，都需要结合模型、处理方式及其他实验结果解释，不能直接把它当作铁死亡是否发生的判定标准。
如果在样本量、检测范围或指标搭配方面不确定，可以结合样本类型与实验设计，向 Abbkine 技术支持咨询。
技术支持电话：400-6800-830
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参考文献
Lv B, et al. DMT1 ubiquitination by Nedd4 protects against ferroptosis after intracerebral hemorrhage. CNS Neuroscience & Therapeutics. 2024;30(4). 查看原文
Kim JW, et al. GPX4 overexpressed non-small cell lung cancer cells are sensitive to RSL3-induced ferroptosis. Scientific Reports. 2023;13(1):8872. 查看原文
Monirujjaman M, et al. Dietary EPA+DHA mitigate hepatic toxicity and modify the oxylipin profile in an animal model of colorectal cancer treated with chemotherapy. Cancers. 2022;14(22):5703. 查看原文
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