6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)活性检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或紫外分光光度计（能测 340 nm处的吸光度）
• 96孔 UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 制冰机、低温离心机、水浴锅
• 去离子水
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

试剂盒组分

ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

Working Solution：临用前配制，ReagentⅡ和 ReagentⅢ全部转移到 ReagentⅠ，充分混匀待用；未用完的试剂-20℃避光保存一周，避免反复冻融。

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 植物组织：称取约 0.1 g样本，加入 1 mL Extraction Buffer捣碎，冰浴超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 细胞或细菌：收集 2,000万细胞或细菌到离心管内，用冷 PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 mL Extraction Buffer，冰浴超声波破碎细胞或细菌 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），然后 8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
4. 血清（浆）样本：直接检测。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热 30 min以上，调节波长到 340 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。
2. Working Solution于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 10 min。
3. 操作表（下述操作在 96孔 UV板或微量石英比色皿中操作）：

迅速混匀后于 340 nm检测，记录 10 s和 3 min 10 s的吸光值，分别记为 A1和 A2，计算ΔA 测=(A 测 2-A 测 1)-(A 空 2-A 空 1)。

结果计算

A. 使用 96孔 UV板测定的计算公式

1. 血清（浆）6PGDH活力的计算

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟生成 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

2. 组织中 6PGDH活力的计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成 1 nmol的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

(2) 按样本质量计算

单位的定义：每 g组织质量每分钟生成 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

3. 细胞或细菌中 6PGDH活力的计算

单位的定义：每 1万个细胞或细菌每分钟生成 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

V 反总：反应体系总体积，0.2 mL=2×10-4 L，V 提取：提取液体积，1 mL；V 样本：反应体系中上清液体积，0.01 mL；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96孔板直径，0.5 cm；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；T：反应时间，3 min；W：样本质量，g；2,000：细胞或细菌总数，2,000万；109：单位换算系数，1 mol=109 nmol。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径 d: 0.5 cm调整为 d: 1 cm进行计算即可。