应用指南 2026-09-02 阅读

TC总胆固醇检测实验全流程：血清、组织、细胞样本通用操作指南

承认吧，你点开这篇文章，多半是因为刚刚搞砸了一块96孔板。

要么是标准孔的颜色淡得像白开水，要么是辛苦从组织里提出来的样本测出来全是"未检出"。你翻遍了手里那份说明书，找不到任何排错方向——说明书会告诉你加多少微升液体，但不会警告你：组织取量过多会让提取液变粘稠导致体系崩溃；也不会告诉你TC提取液里的无水乙醇会让你后续的BCA蛋白定量全线失准。

这篇指南补的就是这些空白。把每个操作节点背后的逻辑说清楚，让你在实验不顺的时候知道从哪里开始排查。

所有操作参数均以 CheKine™ KTB2220 总胆固醇检测试剂盒（微量法） 说明书为准。

实验前：三件必须提前想清楚的事

1. 你的样本量够吗？先做预实验

说明书建议选择2–3个预期差异较大的样本先做预实验，不是废话。TC在不同组织、不同处理组之间的含量差异有时超过一个数量级，正式实验前不摸底，样本量要么太多（OD超线性区需稀释）要么太少（OD低到检测不到），两种情况都要重做。

预实验的目标很明确：让ΔA测定落在合理区间内。低于0.01就加大样本量；高于1.0就用无水乙醇稀释并记录稀释倍数n，计算结果乘以n。

2. 归一化方案提前想好

这是很多人实验做完才开始后悔的问题。KTB2220总胆固醇试剂盒提供四种计算公式（按蛋白浓度、按质量、按细胞数、按体积），实验设计时就要确认用哪种方式归一化，并据此决定是否同步制备蛋白定量样本。

关键警告：TC提取液（无水乙醇）会使蛋白质变性。 用同一管提取液做BCA蛋白定量，测出来的蛋白浓度是失真的，用它归一化TC数据会产生系统性误差。正确做法是另取一份相同量的样本，用去离子水重新制备蛋白定量样本，与TC提取平行进行，同批处理。

3. 试剂平衡到室温

Reagent Ⅱ、Reagent Ⅲ、Standard均需使用前平衡到室温。酶在低温下活性受抑，直接用从4℃取出的试剂加样，孵育30 min后反应可能还未到达终点，ΔA测定会系统性偏低。

试剂准备：Working Solution是第一个容易翻车的地方

Working Solution由Working Reagent Ⅰ和Reagent Ⅲ按 1:3体积比 混合而成，现配现用。每孔需要200 μL，按实际用量加约20%富余量配制。

Working Reagent Ⅰ的配制步骤（严格按顺序操作）：

取出Reagent Ⅰ粉末瓶，48T规格量取4 mL Reagent Ⅱ，96T规格量取8 mL Reagent Ⅱ
将Reagent Ⅱ加入Reagent Ⅰ粉末瓶，轻柔旋转混匀，直至粉末完全溶解——目视确认原瓶底部无残余粉末
将溶解好的液体全部转移至Working Reagent Ⅰ空瓶，盖紧瓶盖

为什么粉末必须完全溶解？ Reagent Ⅰ中含有酶组分，如果有未溶解的粉末残留在原瓶底部，那部分酶就直接损失掉了，Working Reagent Ⅰ的实际酶浓度低于应有值，后续显色会偏弱，ΔA标准异常低。这是整批实验失败的最常见原因之一，但说明书里只写了"充分溶解"，没有说明不溶解的后果。

比例确认： Working Solution的1:3是 Working Reagent Ⅰ : Reagent Ⅲ，不是Reagent Ⅰ : Reagent Ⅱ。Reagent Ⅱ只用于溶解Reagent Ⅰ粉末，不参与Working Solution的配制。

保存条件： 配制好的Working Reagent Ⅰ，4℃避光不超过一周；分装后-20℃避光保存一个月，避免反复冻融。

样本制备：三种样本类型的操作要点

血清（浆）

直接检测。解冻平衡至室温后取10 μL加入测定孔即可。

高脂模型动物或高脂饮食干预组的血清TC含量可能很高，预实验中确认ΔA不超过1.0，必要时用无水乙醇稀释（n=2）。

动物组织

精确称取约0.1 g组织（记录实际质量W，用于代入计算），加入1 mL无水乙醇，冰浴匀浆，8000 g、4℃离心10 min，取上清置冰上待测。

为什么是0.1 g？ 这是推荐起点，不是绝对值。不同组织TC含量差异显著，以0.1 g为起点做预实验，根据ΔA测定落点决定是否调整取样量。取样量超过0.2 g时，组织中的蛋白质和脂质会使提取液变粘稠，影响离心效果和后续酶反应的底物可及性，TC测值反而不准。

取样部位的一致性优先于取样量的精确性。 同批实验中每只动物取相同部位、相同深度的组织。肝脏不同叶之间、皮下脂肪与内脏脂肪之间TC含量差异可以很大，取样不一致会引入不可控变异。

提取后的上清应尽快检测；如需暂存，-80℃保存不超过1个月。

细胞或细菌

收集5×10⁶个细胞或细菌，预冷PBS清洗，800 g离心2 min弃上清。加1 mL无水乙醇，冰浴超声破碎：功率20%（或200 W），超声3 s、间隔7 s、重复30次。8000 g、4℃离心10 min，取上清置冰上待测。

超声条件不能随意简化。 功率不足或次数不够，细胞/细菌破碎不完全，胆固醇无法从膜结构中充分释放，TC测值系统性偏低。如果正式实验中ΔA测定低于0.01，先检查破碎是否充分，再考虑增大菌量或适当减小提取溶剂体积。

检测体系配制

酶标仪预热30 min以上，调节波长至500 nm。

试剂	空白孔（μL）	标准孔（μL）	测定孔（μL）
无水乙醇	10	0	0
Standard	0	10	0
样本	0	0	10
Working Solution	200	200	200

空白孔和标准孔每批只需测定1次。测定孔按实验设计做技术重复（通常2–3个）。

加样建议： 先加Working Solution，再加乙醇/Standard/样本。混匀方式用轻拍板边或低速离心（300 g，10 s），不要用移液枪反复吹打——吹打会产生气泡并造成局部温度变化，影响酶活。

孵育与读板

混匀后，37℃孵育30 min，立即在500 nm读取吸光度。

孵育温度直接影响酶反应速率，室温孵育会导致反应不完全，ΔA测定系统性偏低。如果没有37℃培养箱，用水浴锅代替，不要在台面室温孵育。

读板窗口：孵育结束后所有孔必须在1 h内完成读板。 Trinder显色体系的产物在空气和光照下缓慢降解，超时读板导致吸光度漂移，不同时间点读取的孔之间数据不可比。样本量大时，建议分批次孵育，控制每批读板均在窗口内。

结果计算

常见问题排查

ΔA测定 < 0.01

样本TC含量低于检测下限，或提取不充分。优先增大样本量；细胞/细菌样本还需确认超声破碎是否彻底。也可减小提取溶剂体积以提高提取液浓度，计算时相应调整V样总。

ΔA测定 > 1.0

样本浓度超出线性区，用无水乙醇按比例稀释，计算结果乘以稀释倍数n。

ΔA标准异常低（标准孔OD与空白孔几乎无差异）

这是整个检测体系失效的信号，与你的样本无关。这往往是实验中最令人崩溃的情况——所有操作都做完了，标准孔却没有颜色。按以下顺序排查：

Reagent Ⅰ溶解完全了吗？ 原瓶底部是否有残余粉末？溶解不完全是这个问题的头号原因
比例配对了吗？ Working Reagent Ⅰ : Reagent Ⅲ = 1:3，确认没有配反
Working Reagent Ⅰ是否失活？ 是否反复冻融，或在室温放置时间过长？
孵育温度是否实际达到37℃？ 是水浴实测温度，还是台面空调温度？

如果以上四条你都仔细排查过、操作都没有问题，但标准孔依然没有信号——不要再怀疑自己的操作了。胆固醇氧化酶对运输和保存温度极为敏感，部分来源不稳定的产品在冷链不完整或存储不当时酶活会大幅衰减，配出来的Working Solution从根本上就失效了。这时候请果断止损。CheKine™ KTB2220总胆固醇试剂盒全程冰袋（蓝冰）运输，各组分储存条件在说明书中逐一标注，你用它做预实验，标准孔的颜色深浅就是它酶活状态的直接证明。

平行孔OD差异过大（CV > 15%）

通常是加样不稳定或混匀不充分。检查移液枪校准状态，确保每孔加样量准确。样本制备端同样需要排查：组织取样部位是否一致，超声条件是否每批相同。