总胆固醇(TC)检测试剂盒(微量法)-CheKine™

自备耗材

• 酶标仪或可见分光光度计（能测 505 nm处的吸光度）
• 96孔板和微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
• 低温离心机、制冰机、水浴锅
• 无水乙醇
• 匀浆器（如果是组织样本）

试剂盒组分

试剂准备

Working ReagentⅠ：临用前配制；48 T用 4 mL ReagentⅡ充分溶解 ReagentⅠ后将其转移至Working ReagentⅠ瓶中，96 T加入 8 mL ReagentⅡ充分溶解 ReagentⅠ后将其转移至Working ReagentⅠ瓶中。用不完的试剂 4℃保存一周或分装后-20℃避光保存一个月，避免反复冻融。

ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

Working Solution：现配现用，每孔配制 200 μL Working Solution，按照实际用量将Working ReagentⅠ和 ReagentⅢ按照 1:3的比例混合均匀。

Standard：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。

样本制备

1. 动物组织：称取约 0.1 g组织，加入 1 mL无水乙醇，冰浴匀浆，8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞、细菌：收集 500万细胞或细菌到离心管内，弃上清，加 1 mL无水乙醇，超声波破碎 5 min（功率 20%或 200 W，超声 3 s，间隔 7 s，重复 30次），8,000 g，4℃离心 10 min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）：直接测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热 30 min，调节波长到 505 nm，可见分光光度计用去离子水调零。
2. 在 96孔板或微量玻璃比色皿按照下表进行操作：

混匀后 37℃孵育 30 min，于 505 nm测定吸光值，记为 A 空白、A 标准、A 测定，计算ΔA 测定=A 测定-A 空白、ΔA 标准=A 标准-A 空白。

注意：空白孔和标准孔只需测定 1次。

结果计算

1. 样本 TC含量计算

1. (1) 按样本质量计算
TC含量(μmol/g 鲜重)=CStandard×△A 测定÷△A 标准×V 样÷(W×V 样÷V 样总)=1.25×△A 测定÷△A 标准÷W
2. (2) 按蛋白浓度计算
TC含量(μmol/mg prot)=CStandard×V×△A 测定÷△A 标准×V 样÷(Cpr×V 样)=5×△A 测定÷△A 标准÷Cpr
3. (3) 按细菌或细胞数量计算
TC含量(μmol/104)=CStandard×△A 测定÷△A 标准×V 样÷(500×V 样÷V 样总)=0.01×△A 测定÷△A 标准
4. (4) 按液体体积计算
TC含量(μmol/mL)=CStandard×△A 测定÷△A 标准=5×△A 测定÷△A 标准

CStandard: 5 mmol/L=5 μmol/mL；Cpr: 样本蛋白浓度，mg/mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.01 mL；W: 样本鲜重，g；V 样总: 样品制备加入 Extraction Buffer的体积，1 mL；500: 细胞或细菌总数，500万。